副猪嗜血杆菌sodA基因的表达及其理化性质

为探究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)sodA基因编码的超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的活性及理化性质,设计特异性引物从HPS中扩增得到目的基因sodA,利用原核表达系统对HPS SOD蛋白进行表达,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300凝胶过滤层析以及DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析等方法对表达蛋白进行了分离纯化,利用邻苯三酚自氧化法对纯化产物进行SOD酶活性检测,通过HPSEC法、火焰原子吸收分光光度法对其理化性质进行了初步探究。结果表明,表达的重组HPS SOD蛋白质为可溶性蛋白质,单亚基分子质量为26 ku,纯化后目的蛋白质纯度为95%,纯化后的重组HPS SOD蛋白质比活性为215.9 U/mg,经HPSEC法检测分析,重组HPS SOD呈多聚体,通过火焰原子吸收分光光度法检测纯化的重组HPS SOD中锰元素含量为0.71 mg/L。

非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立一种检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA(iELISA)方法,对构建的ASFV P30基因表达工程菌诱导表达后,将获取的重组ASFV P30蛋白进行纯化和Western-blot检测,然后以纯化的重组蛋白为抗原,建立了ASFV抗体iELISA检测方法,并进行了特异性、灵敏性、重复性试验;同时与基于ASFV P30-2His6蛋白(N、C末端各融合1个His6标签)的iELISA方法进行兽医临床样本比较试验。结果显示:重组ASFV P30蛋白和重组ASFV P30-2His6蛋白在Western-blot检测中,均能与猪ASFV阳性血清产生特异性杂交带;基于重组ASFV P30蛋白iELISA的最佳反应条件为,抗原蛋白包被质量浓度20μg/mL、血清样品稀释度1:1000、酶标二抗稀释度1:40000、血清样品检测OD450阳性结果临界值0.22。该方法仅对ASFV阳性血清呈特异性反应,1:3200稀释的阳性血清仍可检出,批内试验和批间试验变异系数均小于10%,可以消除His标签所造成的假阳性反应。本研究建立的ASFV P30 iELISA检测方法为ASFV抗体检测提供了一种有效手段。

一株禽腺病毒4型Fiber2蛋白单克隆抗体的制备

制备禽腺病毒4型(FAdV-4)Fiber2蛋白的特异性单克隆抗体,将重组蛋白FAdV-4 Fiber2纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,分离脾脏中的淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,筛选得到10株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株1B5F1、1B5G11、1B5C1、1B5D2、1B5E3、1B5F3、1B5E4、1B5G4、1B5A8、1B5G8,取分泌抗体水平最高的1B5F1细胞株制备腹水,利用斑点杂交(Dot blot)和间接免疫荧光试验(IFA)进行特异性检测。结果表明,成功制备10株杂交瘤细胞株;制备的腹水能与FAdV-4 Fiber2蛋白及FAdV-4攻毒后的鸡肝组织产生特异性反应,证明成功制备了FAdV-4 Fiber2蛋白特异性单克隆抗体。

重组猪尿酸氧化酶基因突变及其对聚乙二醇化的影响

目的对重组猪尿酸氧化酶(recombinant porcine urate oxidase,r PUOX)进行突变改造,以增加rPUOX上可供聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)耦合的赖氨酸(Lys)残基数,探究PEG修饰对改造前后的酶液在SPF鸡体内的药效和抗原屏蔽作用的影响。方法对纯化的基因改造前后的r PUOX进行PEG化修饰,修饰蛋白静脉注射SPF鸡,共4次,每次间隔7 d。实验分为20×5K PEG-rPUOX-215组、20×5K PEG-rPUOX组和空白对照组(0.9%生理盐水)。于鸡翼根静脉处采血,用血糖尿酸测试仪及尿酸测试条测定尿酸浓度,酶反应-紫外分光光度法检测尿酸酶活性,间接ELISA法检测免疫原性。结果 20×5K PEG-r PUOX-215和20×5K PEG-rPUOX均获得充分修饰,且前者修饰效果更好。第1、2次注射,降低鸡血尿酸幅度20×5K PEG-rPUOX-215组高于20×5K PEG-rPUOX组约11%和6%。3次注射药效维持时间20×5K PEG-rPUOX组相较于20×5K PEG-rPUOX-215组逐次降低0、24和48 h。20×5K PEG-rPUOX-215组抗体产生速率相对较慢,且14 d抗体阳性率低于20×5K PEG-rPUOX组约14.3%。结论 20×5K PEG-rPUOX-215修饰后药效学作用更显著,药物半衰期延长,且免疫原性相对较低,为研制低免疫原性的rPUOX及实现临床上多次给药提供了新的方法和思路。