基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体TaqMan检测方法的建立及其遗传演化分析

热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的Hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株Hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae, Mccp)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii, AL)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae, Maga)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)等牛羊常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为5.72 copies·μL^(-1);重复性优,组内变异系数和组间变异系数均小于1.00%。6株Movi分离株Hsp70基因全长均为1 818 bp,与其它Movi参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.4%和98.0%~100.0%;进一步分析发现,山羊源Movi均比绵羊源多1个N-糖基化位点。遗传演化分析表明,其均处于ClusterⅠA亚分支(均为山羊源)。综上,本研究建立了特异性强、敏感性高、重复性优的基于Hsp70基因的Movi的qPCR检测方法。序列分析发现,不同来源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性高;遗传演化分析证实,Movi福建株与山羊源分离株遗传关系较近。本研究不仅为Movi临床诊断提供了技术支持,更为进一步了解Movi遗传演化规律提供参考。

不同施氮水平下硅肥对谷子抗倒伏能力、产量和品质的影响

[目的]倒伏严重影响谷子产量和品质。探究不同施氮水平下硅肥提高谷子茎秆强度、产量及品质的作用,为谷子高产高效施肥提供技术方案。[方法]以晋谷21和张杂13为供试谷子品种,在山西太谷进行大田试验。在常规施氮量N_(1)(180 kg/hm^(2))和高施氮量N_(2)(450 kg/hm^(2))下,分别设置不施硅、施用硅酸钠(Si_(1),SiO_(2) 68.85 kg/hm^(2))和硅钙肥(Si_(2),SiO_(2) 67.2 kg/hm^(2)),共6个处理。在谷子成熟期测量其株高、抗倒伏能力相关指标、光合特性、产量和品质相关指标,并观察茎秆横切面显微结构。[结果]N_(1)水平下,施用硅肥降低了谷子基节长度,增加了茎粗、茎秆抗折力和穿刺力,晋谷21和张杂13两品种前五基节的节间长度分别降低了4.1%~30.1%和9.5%~11.5%,茎粗分别增加5.3%~19.4%和13.0%~34.1%;晋谷21抗倒性在N_(1)-Si_(1)处理较强,第一、第二基节抗倒伏指数较N_(1)-Si_0处理分别增加37.4%和35.8%,张杂13在N_(1)-Si_(2)处理时较强,第一、第二基节抗倒伏指数较N_(1)-Si_0处理分别增加136.0%和94.7%。N_(2)水平下,施用硅肥后晋谷21和张杂13前五基节的节间长度分别降低了9.6%~30.3%和10.6%~14.9%,茎粗分别增加了9.56%~23.9%和16.2%~31.0%,茎秆扁平度降低。硅钙肥对谷子茎秆强度影响大于硅酸钠,N_(2)-Si_(2)处理晋谷21的第二基节抗折力、穿刺力和抗倒伏指数比N_(2)-Si_0分别增加97.9%、77.6%和83.3%,张杂13的第一基节抗折力、穿刺力和抗倒伏指数比N_(2)-Si_0分别增加74.0%、66.8%和128%。施硅后谷子茎秆中机械组织增厚,维管束数量增多且排列均匀,向茎秆中心延伸,且在N_(2)水平下,硅钙肥作用效果优于硅酸钠。硅可促进谷子穗码发育,增加穗粗、穗粒数和千粒重,在高氮水平下硅钙肥处理使晋谷21和张杂13的产量分别增加23.8%和24.0%。施用硅肥能够提高谷子脂肪、蛋白质和氨基酸含量,在高氮水平下可以降低谷子直链淀粉/支链淀粉值。[结论]在高氮条件下,施用硅钙肥使谷子前五基节长度降低,茎粗增加,机械强度增加,进而提高抗倒伏能力;施用硅肥还可增加光合速率和蒸腾速率,促进物质积累和运输,增加产量,改善品质。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒MAb的制备及间接ELISA方法的建立

为建立检测山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的间接ELISA方法,本研究以纯化的ENTV-2免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株能够稳定分泌ENTV-2特异性单克隆抗体(MAb)的细胞株,命名为6E4,并采用鼠MAb亚类鉴定试剂盒鉴定6E4 MAb的亚类,结果显示,MAb 6E4的亚类为κ链、IgG1亚型。进一步以6E4为检测抗体,经各反应条件的优化建立了检测鼻液样品中ENTV-2的间接ELISA方法,该方法的临界值为0.323。利用该方法检测羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Movi)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)以及纯化的ENTV-2和ENTV-2患病羊鼻液样品,结果显示,除纯化的ENTV-2及ENTV-2患病羊鼻液样品的检测结果呈阳性外,ORFV、Movi、Mmc的检测结果均为阴性,该方法特异性较强。将纯化的ENTV-2(以蛋白浓度换算)2倍倍比稀释(20μg/mL~0.08μg/mL)后,利用建立的间接ELISA方法检测,结果显示,纯化的ENTV-2稀释至0.3125μg/mL时检测结果仍可判定为阳性,该方法敏感性较高。批内、批间重复性试验结果显示,二者变异系数均小于10%,该方法重复性较好。采用荧光定量RT-PCR方法和本实验建立的间接ELISA方法检测109份临床鼻液样品,比较二者之间的符合率,结果显示,该间接ELISA方法与本研究室前期建立的荧光定量RT-PCR的检测结果符合率达94.5%,表明本研究建立的间接ELISA方法可用于ENTV-2感染的临床快速检测。本研究建立的ENTV-2间接ELISA方法为ENT的净化提供了技术手段。

牛轮状病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)便捷检测方法,为福建省BRV的流行病学调查检测提供便捷技术支持。【方法】根据GenBank公布的BRV基因组序列,利用Oligo7.0软件设计并合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测BRV的RT-PCR方法,同时开展了特异性、敏感性和重复性试验,并将建立的方法应用于22份临床样品的检测。【结果】建立的方法仅能够扩增出BRV的特异性片段,对其他畜禽常见病原体无特异性扩增;该方法的灵敏度为6.86×10^(5)copies·μL^(-1)。对22份临床样品进行检测,检测出12份阳性样品,阳性率为54.55%。【结论】本研究建立的BRV RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床样本的检测,为福建省BRV的诊断和流行病学调查提供了技术支持。

福建省福清市山羊地方性鼻内肿瘤病毒2型感染流行病学调查

为了解福建省福清市山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)流行及遗传变异情况,通过Taq Man qPCR检测方法,对998份山羊鼻拭子样品进行ENTV-2核酸检测,并对阳性样品SU蛋白编码基因进行遗传进化分析。结果显示:在福清市16个镇街40个山羊养殖场户中,共检测出19个阳性场户、89份阳性样品,场阳性率为47.50%,个体阳性率为8.92%;9份阳性样品的SU蛋白编码基因均与ENTV-2位于同一进化分支,其中2份阳性样品处于相对独立的分支,与ENTV-2流行株同源性约为96%,且各有5处氨基酸突变,其他阳性样品与ENTV-2流行株同源性在99%以上,氨基酸序列一致。结果表明,ENTV-2在福清市流行较为广泛,流行毒株出现了一定的变异,需要持续加强监测,采取综合措施控制该病流行。本研究有助于了解和掌握ENTV-2在山羊群中的感染情况和遗传变异特征,为提高该病防治效果奠定了基础。

番鸭呼肠孤病毒的鉴定

从以软脚为主要临床症状,以肝、脾表面有多量灰白色坏死点,肾肿大及出血为主要病变的病番鸭肝、脾组织中分离到5株病毒(MW9710、MW9803、MW9806、MW9809和MW9810)。雏番鸭和雏鹅经人工感染后出现与自然病例相同的临床症状和病理变化,并能回收到病毒。樱桃谷鸭、麻鸭和鸡人工感染不发病。经电镜观察,病毒呈球形,正二十面体,立体对称,无囊膜,有双层衣壳,直径为60nm～73nm,病毒粒子在胞浆中增殖。病毒对乙醚、氯仿、胰蛋白酶、50℃处理1h和3%甲醛处理不敏感。对pH3处理2h、60℃处理30min和紫外线照射敏感。1mol/LMg Cl2不能增强病毒的感染力。病毒核酸型为dsRNA,病毒核酸具有禽呼肠孤病毒的特征:有10条带,按其大小可分为三类:大片段(L1～L3)、中片段(M1～M3)和小片段(S1～S4)。但是MW9710株的M2和S1～S4片段的迁移率明显不同于鸡关节炎病毒(ARV)S1133株,而与番鸭呼肠孤病毒法国株(89330、89026株)的核酸电泳图谱极为相似。在血清中和试验中,ARVS1133和MW9710株互不交叉。并且,以针对ARVS1基因的特异性引物XZ11、XZ12对MW9710株等进行RT PCR扩增,只能从ARV中扩增出特异性条带;而以MDRV89026株S1基因的特异引物HP11、HP12进行RT PCR扩增,只能从MW9710等分离毒株中扩增出特异性条带。上述结果表明。

应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒

参考 Gen Bank中番鸭呼肠孤病毒 (m uscovy duck reovirus,MDRV ) S1基因序列 ,用计算机设计并合成了 1对引物 HP11、HP12 ,以此引物用 RT- PCR对番鸭呼肠孤病毒 S1基因进行了特异性扩增。结果表明 :引物 HP11、HP12能从所有供试的 4株分离毒 MDRV- MW9710、MW980 6、MW980 9、MW9810扩增出 30 0 bp S1基因 c DNA片段 ,而不能从禽呼肠孤病毒 (ARV) S1133株和番鸭胚成纤维 (MDEF)细胞培养物中扩增出任何片段 ;该 RT- PCR的检测灵敏度为 1pg的病毒核酸 ,特异性强 ,重复性好 ,对含毒细胞培养液和尿囊液只需用氯仿进行简单处理 ,即能检测出 MDRV核酸。因此认为 ,该 RT-

番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因片段的克隆及序列分析

参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovyduckreovirus,MDRV)S1基因序列设计合成一对引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因进行RT＿PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序。结果显示扩增产物为300bp,与预期的目的片段大小一致,经PCR、酶切反应鉴定后克隆到pGEM＿Teasy载体中,核苷酸序列经BLAST软件分析表明:番鸭呼肠孤病毒MW9170株S1基因的目的片段与番鸭呼肠孤病毒法国89026株同源性为91 7%,与鸡关节炎病毒S2基因同源性为68 7%,结果提示番鸭呼肠孤病毒MW9710株与鸡关节炎病毒亲缘距离较远。

应用PCR快速鉴别番鸭和鹅细小病毒

根据已发表的番鸭和鹅细小病毒基因组全序列 ,设计并合成了 1对通用引物 (PC1/PC2 )和 1对MPV特异引物 (PS1/PS2 )。以MPV_DNA、MPV尿囊液、MPV尿囊液和GPV尿囊液混合液、GPV_DNA、GPV尿囊液和GPV细胞培养物、DHV尿囊液和H2 O为模板在同一条件下分别以 2对引物进行扩增 ,PCR产物经 1 5 %琼脂糖凝胶电泳分析 ,结果显示 :在PC1/PC2系统中 ,除DHV尿囊液和H2 O外 ,所有样品均出现长约 4 80bp的特异核酸带 ,对MPV_DNA的敏感性为 0 2pg ,对GPV_DNA的敏感性为2pg ;对MPV尿囊液的敏感性为 10 0ELD50 / 2 μl;PS1/PS2系统中 ,只有MPV_DNA、MPV尿囊液及MPV尿囊液和GPV尿囊液混合液出现预期约 110 0bp特异扩增产物 ,对MPV_DNA的敏感性为 0 2ng ,对MPV尿囊液的敏感性为 10 0 0ELD50 / 2 μl,而GPV_DNA、GPV尿囊液、GPV细胞培养物、DHV尿囊液和和空白对照均未见到条带。分别以 1ngMPV_DNA、1ngGPV_DNA、MPV尿囊液、GPV尿囊液、DHV尿囊液和空白对照样品进行扩增 ,3次重复实验结果完全一致。表明该PCR检测技术可准确、快速鉴别番鸭和鹅细小病毒 ,为临床上准确。

雏番鸭细小病毒病的流行病学调查

自1985年以来,在福建莆田、仙游、福州等地区陆续发现雏番鸭以腹泻、呼吸困难和脚软为主要症状的疾病,该病多发生于3周龄以内,剖检以胰腺上有灰白色小点。

磁场对正丁醇与乙酸酯化反应的影响

研究发现在０．３Ｔ磁场强度下乙酸与正丁醇混合酯的生成量最高，正丁醇的粘度和表面张力的下降率最大。ＩＲ显示经磁场处理后，正丁醇的羟基伸缩振动吸收峰变窄，表明，磁场能够降低体系内分子间的氢键缔合，增强醇与酸的反应活性。

一种新的番鸭疫病(暂名番鸭肝白点病)病原的发现

利用番鸭胚从患有以软脚为主要临床症状 ,以肝、脾表面有多量白点 ,肾肿大、出血为主要病变的疫病 (暂称为“番鸭肝白点病”)的雏番鸭肝、脾中分离到 5株病毒。番鸭胚经病毒接种后 2～ 5 d死亡 ,胚体枕部、颈部、背部充血、出血 ,部分胚体肝、脾表面有灰白色小点 ,直径约 0 .5 mm。病毒经适应后能在番鸭胚成纤维细胞中增殖并传代 ,产生细胞病变。雏番鸭经人工感染后出现与自然发病鸭相同的临床症状和病理变化 ,并回收到病毒。经电镜观察 ,病毒呈球形 ,正二十面体、立体对称 ,无囊膜 ,直径为 6 0 nm左右。病毒粒子在胞浆中增殖。病毒对胰蛋白酶、氯仿和 5 0℃处理 1h不敏感 ,对紫外线、 6 0℃处理 1h、 70℃处理 1h、 80℃处理 1h敏感 ,病毒核酸型为 RNA;病毒不能致死鸡胚 ;对鸡、鸭、鸽红细胞均无凝集作用 ;与番鸭细小病毒、鹅细小病毒和鸭流行性出血症病毒无抗原交叉关系 ,表明该病毒是番鸭肝白点病的病原 ,是一种新的

奶牛真胃左方变位时血液电解质及酸碱平衡失调

一、研究目的奶牛真胃左方变位的记载将近百年(Carougean和Prestat,1898),本世纪五十年代以后发病率大有上升趋势,经济损失除病牛死亡外,单以奶产量和治疗费用。

四种检测番鸭细小病毒抗原方法的比较

用 L PA、VI、FA和 EL ISA四种方法平行检测了 9羽人工感染鸭和用 L PA、VI及 FA三种方法平行检测了 2 8羽野外送检鸭肝、脾及肝和脾混合组织中 MPV抗原 ,结果显示 :L PA、FA和 EL ISA均有很强的特异性 ;四种方法对人工感染鸭 MPV抗原的检出率均在 88.9%以上 ,任何两种方法之间检测结果的符合率均在 88.9%以上 ,无显著性差异 (X2 检验 ,P>0 .0 5 ) ;三种方法中两两之间检测野外送检鸭 MPV抗原结果的符合率均在 82 .1 %以上 ,亦无显著性差异 (X2 检验 ,P>0 .0 5 ) ;L PA检测肝和脾混合组织的阳性率 (6 4.3% )高于单个组织 (肝 6 0 .7%、脾 5 7.1 % ) ,表明 L PA、 VI、 FA和 EL ISA检测病鸭组织中MPV抗原均有很强的特异性和检出率 ,都可用于诊断番鸭细小病毒病。L PA具有快速、操作简便、结果判定直观等优点 ,易于基层单位和专业户推广应用 ,是诊断番鸭细小病毒病的实用方法。

番鸭呼肠孤病毒病(肝白点病)研究进展

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)病(番鸭肝白点病、白点病、花肝病)是由番鸭呼肠孤病毒引起的番鸭一种高发病率、高致死率的传染病,该病主要发生于40 d内番鸭,临床上以软脚、腹泻、生长障碍为主要症状,以肝、脾表面坏死、纤维素性心包炎为主要病变.Kaschula等(1950年)在南非首次报道了该病的发生,法国学者Gaudry等(1972年)在国际上首次从患上述症状和病变的番鸭中分离到番鸭呼肠孤病毒,目前该病已广泛流行于法国、以色列、德国、意大利等国.在我国,番鸭呼肠孤病毒病是1997年新发现的番鸭传染病,最早在福建莆田、福清等地发生,以后相继在广东佛山、浙江金华和我国各番鸭饲养区发生,以肝、脾出现灰白色小点为主要病变,俗称番鸭"肝白点病"、"白点病"、"花肝病",发病日龄以10～30 d居多,发病率为30%～90%,病死率为60%～80%,病鸭耐过后成为僵鸭,当时临床上无法防治,引起国内学者的广泛关注.本文就该病的病原学、诊断、防制技术做一综述. ……

养鸭生产中几种新发疫病的防治

本文主要针对近年养鸭生产中几种新发疫病,如番鸭细小病毒病、新型鸭呼肠孤病毒病、鸭坦布苏病毒病等的流行特点进行分析,并提出相关预防与治疗方法。

鹅细小病毒诊断与防治的研究进展

鹅细小病毒病或称小鹅瘟（GooseParvovims，GPV），是由鹅细小病毒引起的雏鹅和雏番鸭的一种急性或亚急性败血性传染病。该病于1956年由方定一教授首次在江苏扬州发现。20世纪60年代中后期，在亚洲、欧洲、美洲等国家相继报道该病的发生与流行。该病主要侵害3～20日龄的雏鹅，也感染雏番鸭，传播快，发病率和死亡率较高，特征表现为水样腹泻，渗出性肠炎，乃至腊肠样栓塞。

鹅和番鸭细小病毒全基因克隆与序列分析

本研究采用PCR技术扩增了鹅和番鸭全长细小病毒基因;其中鹅和番鸭细小病毒非结构蛋白基因(NS)全长为1884bp,编码627个氨基酸;结构基因(VP)全长为2199bp,编码732个氨基酸;序列分析表明:鹅和番鸭细小病毒NS之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为80.9%～82.9%和89.5%～91.2%,而相应的鹅细小病毒之间的同源性为93.7%～99.8%和96.8%～99.7%,番鸭细小病毒之间的同源性为98.8%～99.8%和98.6%～99.5%;在核苷酸和氨基酸水平上,鹅和番鸭细小病毒VP1之间的同源性分别为79.7%～88.7%和85.5%～93.3%,而相应的鹅细小病毒之间的同源性为88.8%～99.6%和91.5%～99.2%,番鸭细小病毒之间的同源性为98.1%～99.6%和97.1%～98.8%;番鸭和鹅细小病毒NS和vp1基因的系统进化树分析表明:番鸭和鹅呼细小病毒来自共同的祖先,但随着宿主的不同而演化为不同的分支。