犏牛ACACA和SCD1基因多态性及其与产奶性状的关联分析

旨在分析犏牛ACACA与SCD1基因的单核苷酸多态性,筛选用于犏牛产奶性状辅助选择的分子标记.通过使用PCR结合DNA测序技术对红原地区384头犏牛ACACA基因和SCD1基因多态性进行检测,并对其多态位点上的不同基因型与犏牛产奶性状进行关联性分析.结果显示,ACACA基因在5′UTR区域存在1个SNP位点即g.1488 C>G,SCD1基因的第5外显子内存在1个SNP位点即g.239 A>T;经检验发现,2个SNPs位点均存在3种基因型,且均处于Hardy-Weinberg平衡状态.关联性分析发现,g.1488 C>G和g.239 A>T位点的多态信息含量(PIC)分别为0.35和0.36,即0.25<PIC<0.5均具有中度多态信息性.在试验群体中g.1488 C>G位点与g.239 A>T位点与乳脂率关联性较高(P<0.05).g.1488 C>G位点在乳蛋白率上存在关联性(P<0.05).以上结果表明,ACACA与SCD1基因可以作为犏牛产奶性状辅助选择的候选分子标记.

犏牛和牦牛ESCO2基因的序列特征及其在睾丸中的表达对比分析

旨在克隆犏牛和牦牛姐妹染色单体内聚建立蛋白2(establishment of sister chromatid cohesion N-acetyltransferase 2,ESCO2)基因,并分析其在不同发育阶段睾丸中的表达与定位,为进一步解析ESCO2在减数分裂过程中的作用机制提供理论依据。本研究以健康雄性犏牛及牦牛为试验动物,根据年龄分为胎牛组(5~6月龄)、幼年组(1~2岁)和成年组(3~4岁),每组各3头。通过RT-PCR技术克隆犏牛和牦牛ESCO2基因并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测ESCO2基因在犏牛不同组织中的表达谱,比较分析ESCO2在犏牛和牦牛不同时期睾丸中的表达规律,利用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)技术检测ESCO2蛋白的细胞定位和表达差异。结果显示,犏牛ESCO2基因(GenBank登录号:MW198470)CDS区为1833 bp,编码610个氨基酸,与牦牛相比,犏牛ESCO2序列第301~319位多19个氨基酸,另有3个氨基酸突变;犏牛ESCO2蛋白序列与黄牛的同源性高于其他哺乳动物;ESCO2可能与SMC3、SMC1A、PDS5A、PDS5B、STAG2等蛋白相互作用,互作蛋白功能与姐妹染色单体凝聚、减数分裂细胞周期、DNA修复、细胞分裂和染色体重构等生物学过程相关。ESCO2在犏牛各组织中均有表达,但在睾丸中的相对表达水平显著高于其它组织(P<0.05);在犏牛睾丸中的表达随年龄增长呈上升趋势,幼年和成年时期犏牛睾丸中ESCO2的表达显著低于同时期牦牛(P<0.05);IHC染色结果发现,雄性犏牛减数分裂阻滞于初级精母细胞,ESCO2蛋白在犏牛初级精母细胞中无表达并与牦牛存在差异。本研究结果表明,犏牛与牦牛的ESCO2基因、蛋白序列差异较大,且在睾丸发育过程中的表达模式差异显著,这可能是引起雄性犏牛减数分裂阻滞及不育的原因之一,其具体作用机制有待进一步研究。

犏牛PPP1R11基因的克隆及在睾丸中的表达规律研究

旨在克隆犏牛蛋白磷酸酶1调节亚基11(protein phosphatase 1 regulatory subunit 11,PPP1R11)基因,分析其在不同发育阶段睾丸中的表达与定位,为解析其在雄性生殖中的功能机制提供理论依据。本研究采集成年犏牛睾丸、附睾、心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、肌肉和脂肪组织(n=3),犏牛和牦牛在胎牛时期(5~6月龄)、幼年时期(1~2岁)和成年时期(3~4岁)睾丸(n=3)作为试验材料。通过RT-PCR技术克隆犏牛PPP1R11基因并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)构建PPP1R11基因在犏牛不同组织中的表达谱,比较分析PPP1R11在犏牛和牦牛不同时期睾丸中的表达,利用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)技术检测PPP1R11蛋白的细胞定位和表达。结果显示,犏牛PPP1R11基因CDS区为324 bp,编码107个氨基酸,犏牛PPP1R11蛋白与其他哺乳动物同源性较高;PPP1R11可与PPP1R2、PPP1R7、PPP1CB和UTP20等蛋白相互作用,互作蛋白功能主要与蛋白质的磷酸化相关,参与调控睾丸发育、精子发生和性成熟等生物学过程。PPP1R11在犏牛组织中广泛表达,其中在睾丸组织中的表达量最高,相对表达水平极显著高于其它组织(P<0.01);该基因在犏牛睾丸中的表达量随年龄增长呈上升趋势,幼年和成年时期犏牛睾丸中PPP1R11的表达与同时期牦牛相比差异极显著(P<0.01);IHC染色结果发现,PPP1R11蛋白在犏牛精原细胞和支持细胞中低表达并与牦牛存在显著差异,雄性犏牛初级精母细胞数量减少并且减数分裂阻滞于此。本研究表明,犏牛与牦牛PPP1R11在睾丸中存在时空表达差异,提示该基因可能与犏牛雄性不育相关,其具体作用机制有待进一步研究。

牦牛KIF2A基因克隆及其在卵泡与卵母细胞发育过程的表达规律

旨在克隆牦牛驱动蛋白家族成员2A基因(KIF2A),探究其在牦牛不同组织中的表达模式,以及在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达规律,以3~4岁健康、未妊娠母牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、子宫和卵巢组织(n=5)为研究材料,使用RT-PCR技术获得KIF2A基因的编码区序列(CDS),运用MEGA 7.0、SWISS-MODEL等软件分析其生物学特性。使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)检测KIF2A在牦牛各组织中的表达水平;采用免疫组织化学技术分析KIF2A在牦牛不同直径卵泡中的表达模式及定位。将卵泡按照直径的大小分为3组:小(1.0~2.9 mm)、中(3.0~5.9 mm)、大(6.0~9.0 mm)卵泡;RT-qPCR检测KIF2A基因在不同发育时期卵泡中颗粒细胞、卵母细胞减数分裂3个关键时期的表达特性。结果显示,KIF2A基因序列长为1964 bp,其中CDS为1530 bp,编码509个氨基酸,KIF2A蛋白总体带负电,属于疏水性蛋白。KIF2A基因在牦牛各组织中广泛表达,牦牛KIF2A蛋白主要定位于颗粒细胞,且伴随着卵泡的生长发育其在不同直径大小卵泡颗粒细胞中mRNA表达量呈上升趋势。在牦牛卵母细胞成熟过程中,KIF2A基因的表达具有时序特征,其mRNA的表达量呈下降趋势,GⅤ期显著高于MⅠ期和MⅡ期。综上所述,KIF2A可能参与调控牦牛卵泡发育和卵母细胞的成熟过程。

牦牛GSTK1基因序列特征分析及其组织表达谱构建

旨在探讨谷胱甘肽硫转移酶K1(Glutathione S-Transferase Kappa1,GSTK1)基因序列特征.以牦牛为试验对象,通过RT-PCR技术扩增GSTK1基因序列并分析生物信息学,采用RT-qPCR技术构建其在牦牛不同组织中的表达谱.ORF分析显示,牦牛GSTK1基因编码区为618 bp,编码氨基酸为205个.系统发育树分析显示,牦牛与野牦牛(99.68%)、黄牛(99.68%)和野牛(99.40%)之间的同源性最高,与北极熊(87.63%)、野猪(87.25%)和马(87.01%)之间的同源性最低.蛋白预测分析显示,GSTK1蛋白为不稳定的亲水蛋白,存在12个磷酸化位点.高级结构预测分析显示,GSTK1蛋白的主要成分为α-螺旋(50.73%)、无规卷曲(40.00%)和延伸链(9.27%).组织表达分析发现GSTK1在所检测牦牛卵巢、小肠、脾、肝、肾、肌肉、肺和心组织中均有表达,其中表达量最高的组织是肝,表达量最低的组织是脾和心,且与其他组织差异显著(P<0.05).本研究获得了牦牛GSTK1基因的序列特征及组织表达谱,为进一步挖掘牦牛GSTK1基因的功能提供参考依据.

牦牛GnIH基因生物学特征分析及其在卵巢颗粒细胞中亚细胞定位的研究

为探究促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone, GnIH)基因的序列特征及其在牦牛卵巢颗粒细胞中的表达与定位,试验从牦牛卵巢组织cDNA中克隆了GnIH基因,利用在线软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测GnIH基因在牦牛各器官中的表达情况,通过免疫组织化学和免疫荧光法检测GnIH在组织中的表达及定位。结果表明:GnIH基因编码序列(CDS)区大小为591 bp,编码196个氨基酸;牦牛GnIH基因与黄牛和野牦牛同源性最高;GnIH前体为不稳定亲水酸性蛋白,且无跨膜结构,在第26,27个氨基酸间有信号肽区域,同时GnIH前体包含了3个磷酸化位点,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。GnIH基因在卵巢中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05);随着卵泡的增长发育,GnIH基因在卵泡颗粒细胞中的表达量呈上升趋势,大卵泡(≥6 mm)中GnIH基因相对表达量最高,显著高于中(>3~<6 mm)、小卵泡(≤3 mm)(P<0.05),而中、小卵泡之间差异不显著(P>0.05)。GnIH在卵巢颗粒细胞的细胞核及细胞质中均有表达。说明牦牛GnIH基因参与了牦牛的卵泡发育调控。