RFDD-PCR技术用于构建证的相关基因表达谱初探

目的 运用限制性酶切片段差异显示 (RFDD -PCR)技术初步筛选支气管哮喘肾虚证的相关基因 ,以冀探讨构建中医证的相关基因表达谱的一种研究方法。方法 应用RFDD -PCR技术 ,收集支气管哮喘肾虚证患者治疗前后外周血 ,分离其总RNA ,进行DNaseI处理、合成双链cDNA、TaqI限切酶酶切、在其两端连上接头、特异配对于接头的引物来降落PCR扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、AgNO3 染色、回收差异条带并重新PCR扩增、反向斑点杂交、测序、生物信息学分析。结果 共找到 36条差异条带 ,其中 2 5条能用斑点杂交验证 ,选取 3条测序 ,结果与基因库比较未发现同源序列。结论 3条基因片段可能是与支气管哮喘肾虚证相关的新基因 ;RFDD -PCR技术不失为构建中医证的相关基因表达谱的一种好方法。

限制性酶切片段差异显示及其应用

差异显示技术(DD)-PCR是一种研究基因表达差异的重要而应用广泛的方法,传统的差异显示法由于在PCR时采用Poly穴T雪引物和随机引物而导致较高的假阳性率和产物的近Poly穴A雪非编码区的大量扩增。改进后的限制性酶切片段差异显示技术(RFDD)-PCR采用TaqI酶切双链cDNA,连上特殊设计的接头,再用经特殊设计的特异性配对于接头的引物来扩增,因此能重点扩增编码区并能极大地消除假阳性率。由于扩增时引物就带有荧光或放射性核素标记,还使得差异显示条带的检测更为方便、灵敏。本文简要介绍了该法的原理、步骤、应用及其优缺点。

基因芯片技术在中药研究中的应用

目的 论述基因芯片技术的概念、基本过程及其在中药研究中的应用。方法 主要利用近期资料,论述基因芯片技术基本概念、基本过程及其在中药学领域中的研究状况、发展前景和存在的问题。结果 基因芯片技术可广泛应用于中药药理研究、新药开发、中药鉴定、安全性评价及中药理论的现代研究。结论 我们应克服困难,充分利用基因芯片这一新技术为中药的研究开发服务。

肾虚型支气管哮喘患者外周血mRNA差异显示

目的:运用差异显示技术初步筛选肾虚型支气管哮喘的相关基因,为探讨肾虚证的相关基因表达谱打下基础。方法:用限制性酶切片段差异显示技术(RFDD-PCR),收集支气管哮喘肾虚证患者治疗前后外周血,分离纯化其总RNA、合成双链cDNA、TaqI限切酶酶切、在酶切位点两端连上接头、用特异配对于接头的引物进行降落PCR扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染、回收差异条带并重扩增、反向斑点杂交、测序、生物信息学分析。结果:共找到三十六条差异条带,其中二十五条能用斑点杂交验证,选取共性差异条带三条进行测序,结果与基因库比较未发现同源序列。结论:三条基因片段可能是与支气管哮喘肾虚证相关的新基因。

灵芝三萜对小鼠脾脏树突状细胞增殖的影响

目的:观察灵芝三萜(Ganoderma Triterpene,GT)对小鼠脾脏树突状细胞(Dendritic cells,DC)增殖的影响.方法:采用MTT法,以细胞因子(GM-CSF+IL-4)作比较,观察不同浓度GT以及细胞因子+不同浓度的GT对小鼠脾脏DC的增殖作用.结果:GT在实验浓度范围内(40～200μg/ml)均可显著刺激小鼠脾脏DC增殖,但其刺激强度均明显低于细胞因子组;GT+细胞因子,与对照组相比均有显著的促增殖作用,且明显高于细胞因子组.结论:GT不仅能直接促进小鼠脾脏DC的增殖,而且与细胞因子有显著的协同作用.

当归多糖对小鼠脾脏树突状细胞增殖的影响

目的:研究当归多糖(ASP)对体外小鼠脾脏树突状细胞(DCs)增殖的影响。方法:采用MTT法,以细胞因子即粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)+白细胞介素4(IL-4)作比较,观察不同浓度ASP以及细胞因子+不同浓度的ASP对小鼠脾脏DCs的增殖作用。结果:ASP 31.25-250μg/ml可明显刺激小鼠脾脏DCs增殖,与细胞因子组相比,其中间浓度62.5-125 μg/ml作用明显;ASP+细胞因子,与对照组相比,均有显著的增殖作用,且其在较低浓度31. 25、62.5、125μg/ml明显高于细胞因子组。结论:ASP不仅能促进小鼠脾脏DCs的增殖,而且与细胞因子有显著的协同作用,具有类生长因子和协同生长因子的作用。

大鼠肝癌细胞HSV-tk/GCV自杀基因系统的构建及其旁观者效应

目的:构建针对大鼠肝癌细胞的HSV-tk/GCV(以下简称tk/GCV系统)自杀基因治疗系统,建立比较tk/GCV系统作用效果及其旁观者效应大小的细胞模型和检测方法.方法:用包装细胞PT67/tk分泌的重组逆转录病毒的活性颗粒感染大鼠肝癌CBRH7919细胞,用G418筛选3wk获得高耐药性的重组子CBRH7919/tk,扩大培养.提取CBRH7919(tk-),CBRH7919/tk(tk+)细胞的DNA,把HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后,与2种DNA及阳性对照DNA进行点杂交,以检测tk+细胞的DNA是否整合有HSV-tk基因.用0.1、1、10、50、100mg/L的GCV体外作用于tk-、tk+细胞,MTT检测存活率.用GCV体外分别作用于含不同比例tk+细胞的tk+、tk-混合细胞,MTT检测存活率,比较分析各组旁观者效应大小,确定后续实验的合适tk+比例.结果:用G418筛选3wk后获到高耐药性的CBRH7919/tk(tk+)重组细胞.HSV-tk基因片段用Dig标记为探针后进行点杂交,检测到tk+细胞DNA上已整合有HSV-tk基因,而tk-细胞DNA不含HSV-tk基因.GCV对tk+细胞生长抑制和细胞毒作用明显,而且有浓度、时间依赖性,而tk-细胞对GCV不敏感,说明HSV-tk基因已表达且表达产物具有生物学活性.GCV对含5%和10%tk+的混合细胞杀伤率分别为6.0%和25.2%,结果表明5-10%的tk+混合比例下自杀基因系统自身的旁观者效应较低,而且用MTT检测旁观者效应大小时灵敏度比较高,可作为后续研究中药活性成分对旁观者效应增效作用的tk+、tk-混合比例.结论:成功构建了针对大鼠肝癌的HSV1-tk/GCV自杀基因治疗系统,建立了体外快速筛选旁观者效应增效药物的稳定有效的细胞模型和检测方法.

吴茱萸碱对小鼠肝癌细胞生长的抑制和诱导凋亡作用

目的:探讨吴茱萸碱对小鼠肝癌细胞H22的生长抑制、诱导凋亡和对细胞周期的影响。方法:体外试验MTT法测存活率,甲基绿-派诺宁联合染色观察细胞凋亡形态,流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳观察DNA损伤及细胞周期。结果:吴茱萸碱0.5、1、2、4mg/L浓度组对小鼠肝癌细胞H22作用72h细胞存活率分别为60.3±6.6%、54.0±4.3%、40.7±4.8%、26.9±0.9%,作用24h、48h和72h的IC50依次为4.2、3.3和1.4mg/L。甲基绿-派诺宁染色后0.5、1mg/L吴茱萸碱组癌细胞均表现出凋亡特征;2mg/L吴茱萸碱组部分癌细胞开始出现坏死特征;4mg/L有较多癌细胞坏死。48h流式细胞仪检测表明1、2mg/L吴茱萸碱组出现亚二倍体凋亡峰,细胞周期阻滞于G2期,4mg/L吴茱萸碱组亚二倍体凋亡峰不典型,出现坏死单峰。凋亡率对照组为1.2、1、2和4mg/L吴茱萸碱分别为6.4、9.1和11.2%。48h琼脂糖凝胶电泳表明,4mg/L吴茱萸碱组细胞DNA裂成大片段,DNA损伤呈凋亡特征。结论:吴茱萸碱能诱导小鼠肝癌细胞H22的凋亡。

自血穴位注射疗法对哮喘患者IL-4、IL-5、IL-10mRNA表达的影响

目的探讨自血穴位注射疗法对哮喘患者外周血单个核细胞(PBMC)中白细胞介素5(IL-5)mRNA、白细胞介素4(IL-4)mRNA及白细胞介素10(IL-10)mRNA表达的影响。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),半定量测定自血穴位注射疗法治疗前后哮喘患者PBMC中IL-4mRNA、IL-5mRNA及IL-10mRNA的表达情况。结果自血穴位注射疗法治疗后,哮喘患者PBMC中IL-4mRNA与IL-5mRNA表达均低于治疗前水平(P<0.01、P<0.05),IL-10mRNA表达增强,与治疗前水平相比有显著性差异(P<0.01)。结论自血穴位注射疗法通过基因转录水平抑制IL-4、IL-5的表达,增强IL-10的表达而发挥其对哮喘的治疗作用。

丹参注射液对小鼠脾脏树突状细胞增殖的影响

目的:观察丹参(Salvia Miltiorrhiza Bunge,SMB)注射液对小鼠脾脏树突状细胞(Dendrirtic cells,DC)的增殖作用。方法:采用MTT法,以细胞因子(GM-CSF+IL-4)作对照,观察不同浓度SMB以及细胞因子+不同浓度的SMB对小鼠脾脏DC的增殖作用。结果:SMB在试验浓度为100、500、1000μg/ml时可显著促进小鼠脾脏DC增殖。说明SMB单独使用时可明显刺激小鼠脾脏DC增殖。但其刺激强度均明显低于细胞因子组;SMB+细胞因子,与对照组相比均有显著的增殖作用,与单独使用细胞因子组相比,其低浓度组(50、100、500μg/ml)协同作用显著。结论:SMB不仅能直接促进小鼠脾脏DC的增殖,而且与细胞因子有显著的协同作用。

复合平肥茶对单纯性肥胖大鼠脂肪组织UCP-1 mRNA和下丘脑POMC mRNA的影响

目的:观察复合平肥茶对单纯性肥胖大鼠(DIO)体质量、血脂、血糖、白色脂肪组织解偶连蛋白1(UCP-1)和下丘脑阿片促黑色素原(POMC)的影响。方法:50只SD雄性大鼠随机分为低脂组(10只)和高脂组(40只),分别以低脂饲料及高脂饲料喂养,高脂组大鼠造模成功后,随机分为模型组、奥利司他组、复合平肥茶组,每组10只。低脂组和模型组予以蒸馏水灌胃,奥利司他组和复合平肥茶组分别予以奥利司他和复合平肥茶灌胃。治疗结束后,分别检测体质量、血脂、血糖、白色脂肪组织UCP-1 m RANA表达水平和下丘脑POMC mRNA表达水平。结果:复合平肥茶组和奥利司他组体质量增长明显低于模型组(P<0.05),甘油三酯(TG)、血总胆固醇(TC)、血低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL),空腹血糖(FPG)均明显低于模型组(P<0.05);复合平肥茶和奥利司他组脂肪组织UCP-1 mRNA和下丘脑POMC mRNA较模型组均明显升高(P<0.05)。奥利司他组大鼠皮毛发黄,精神萎靡,活动度减少,且大便溏稀不成形,而复合平肥茶大鼠皮毛有光泽,精神可,活动灵敏,大便正常。结论:复合平肥茶可以抑制大鼠体质量的增长,增加UCP-1 mRNA和POMC mRNA表达促使白色脂肪棕色化,保护糖脂代谢平衡。

电针对单纯性肥胖大鼠胰岛素抵抗及下丘脑胰岛素信号分子的影响

目的:观察电针对饮食诱导的单纯性肥胖(diet induced obesity,DIO)大鼠的体质量、胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)及下丘脑胰岛素信号分子等的影响,探讨电针治疗肥胖症的机制。方法:50只SD雄性大鼠随机分为低脂组(10只)和高脂组(40只),分别以低脂饲料、高脂饲料喂养,高脂饲料组制造DIO大鼠模型。造模成功的30只大鼠,随机分为模型组、电针组、西药组,每组10只。电针组电针"后三里"和"曲池",每次20min,每日1次,连续治疗28d;西药组予以奥利司他灌胃,每日1次,共28d;低脂组和模型组不做治疗。治疗结束后,HE染色观察肝脏组织形态学改变,采用生化和放射免疫法分别检测空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)和空腹胰岛素(fasting insulin,FINS),Western Blot法检测磷脂酰肌醇3激酶之亚基p85(phosphatidylinositol-3kinase p85subunit,PI3K-p85)和胰岛素受体底物2(insulin receptor substrate 2,IRS2)蛋白表达水平。结果:光镜下电针组和西药组较模型组脂变细胞在1/2以下,胞浆内脂滴变小,轻度水肿,无炎细胞浸润。电针组大鼠体质量、FPG、FINS、胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance index,HOMA-IR)和PI3K-p85蛋白表达均低于模型组(P<0.01,P<0.05),IRS2蛋白表达与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);西药组大鼠体质量、HOMA-IR和PI3K-p85蛋白均低于模型组(P<0.01,P<0.05),IRS2蛋白表达高于模型组(P<0.05);电针组和西药组各指标比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。西药组大鼠大便溏稀不成形,活动减少,精神萎靡,毛色枯黄,电针组大鼠大便正常,毛色有光泽。结论:电针可通过降低下丘脑PI3K-p85蛋白的表达,改善DIO大鼠的IR情况,抑制大鼠体质量的增长,同时改善肝脏脂变情况,这可能是电针减肥的作用机制之一。且可避免西药组大鼠表现出来的不良反应。