免疫沉淀联合质谱筛选与纳尔逊湾正呼肠孤病毒σNS互作的宿主RNA结合蛋白

目的筛选出宿主细胞中与纳尔逊湾呼肠孤病毒(NBV)非结构蛋白σNS互作的RNA结合蛋白并分析其生物信息学功能。方法本研究通过构建NBVσNS真核表达载体pEF-HA-MB-S3,验证正确后转染HEK293T细胞,所得的细胞蛋白裂解液经RNase A处理后,利用免疫沉淀富集σNS结合蛋白,经LC-MS/MS质谱分析技术鉴定分析互作蛋白,并且借助相关生信工具挖掘蛋白性质和具体功能。结果本实验成功筛选出32个与NBVσNS蛋白存在互作的候选RNA结合蛋白;生物分析结果显示,这些蛋白主要定位于细胞质与细胞核中,并且主要参与细胞代谢、生物调控、病毒翻译与转录等生物学过程。结论本研究初步分析与NBVσNS互作的RNA结合蛋白功能,为深入研究σNS蛋白在NBV生命周期中的作用机制奠定基础。

猪流行性腹泻病毒S蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白的结构和功能,为建立PEDV感染的诊断方法和疫苗开发提供理论依据。【方法】以PEDV经典CV777株为模板,通过PCR扩增获得S、S1基因片段;PCR扩增产物分别克隆pET-30a(+)原核表达载体和pFLAG-CMV-3真核表达载体,构建原核表达质粒pET-30a-PEDV-S和真核表达质粒pFLAG-CMV-3-PEDV-S1;将pET-30a-PEDV-S转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达PEDV-S重组蛋白,通过变性、复性、浓缩纯化重组蛋白并进行Western blotting检测;将PEDV-S重组蛋白免疫C57BL小鼠制备多克隆抗体,获得的多克隆抗体经间接免疫荧光试验(IFA)检测特异性,通过间接ELISA法检测多克隆抗体效价;将pFLAG-CMV-3-PEDV-S1转染至HEK293T细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,经IFA测定PEDV-S1蛋白的抗原性和多克隆抗体的反应性。【结果】成功克隆出PEDV S和S1基因,构建了可表达PEDV-S重组蛋白的原核表达质粒和在HEK293T细胞中高效表达S1蛋白的真核表达质粒;PEDV-S重组蛋白在IPTG为0.5 mmol/L、16℃诱导8 h条件下可获得最高表达量,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,PEDV-S重组蛋白成功表达;ELISA检测结果显示,制备的多克隆抗体效价达1∶3280500;IFA结果显示,多克隆抗体有良好的特异性,可特异性识别PEDV-S和PEDV-S1蛋白。【结论】本研究获得了PEDV-S重组蛋白,并成功表达S1蛋白,制备出PEDV-S蛋白多克隆抗体,为研究S蛋白的结构和功能提供了条件,为揭示PEDV致病机制奠定了基础。

人轮状病毒非结构蛋白2与宿主互作蛋白的筛选及分子对接研究

目的筛选轮状病毒非结构蛋白2(nonstructural protein 2,NSP2)与宿主细胞的互作蛋白,为抗病毒靶标的发掘提供理论依据。方法NSP2-pGEX-6P-1重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,GST亲和层析法获得NSP2-GST纯化蛋白,Western blot进行验证。将NSP2-GST及GST纯化蛋白作为靶蛋白,通过GST pull-down捕获与MA104宿主细胞互作的差异蛋白。经银染后,将差异条带通过蛋白质胶内酶解及质谱法筛选出相应蛋白质,借助Protein Pilot平台过滤肽段,由Paragon算法获得蛋白质名称和相关的生物学功能。通过蛋白质互作网络图和GO功能注释分析,展示互作蛋白间的潜在联系。同时,利用HDOCK软件对排名前三的蛋白质进行分子对接预测,结合对接分数和置信分数加以验证,揭示蛋白质间的可视化对接模型。结果SDS-PAGE和Western blot表明NSP2重组蛋白纯化成功。经GST pull-down联合蛋白质谱鉴定,筛选出PKM2等10种可能与NSP2互作的宿主蛋白质;GO分析及互作图展示出RPS4X、EZR、SUPT16H、EIF2S3介导分子表达,PKM2、LDHA、ATP5A1参与能量代谢,HSP90、ACTB、ANXA2参与生物运动过程,并且彼此之间存在功能联系及互作网络。分子对接显示出PKM2、HSP90、RPS4X与NSP2存在互作关系,相互作用力强,能够形成稳定结构。结论成功发现宿主细胞中PKM2、HSP90、RPS4X等蛋白质与NSP2存在互作关系,为轮状病毒感染过程的探究及相关防控策略的制定提供参考。