一种中药方剂对PDAPP转基因小鼠行为能力的影响

目的 研究中药复方 (CHP )对 PDAPP转基因小鼠认知功能和记忆能力的影响。方法 应用 Morris水迷宫实验测试 CHP 对 PDAPP转基因小鼠和 C5 7非转基因小鼠的认知和记忆能力的影响。结果 CHP 治疗组 PDAPP转基因小鼠在隐蔽平台实验和可见平台实验中的平均潜伏期明显高于对照组和脑复康组 ,探索实验中在 TQ(targetquadrant)中时间的平均百分比和经过平台位置的次数明显高于其他组。结论 CHP 对PDAPP转基因小鼠的认知和记忆能力具有明显改善作用.

CDR3δ2基因修饰γδT细胞的构建及其功能鉴定

目的将全长γ9链mRNA和肿瘤反应性CDR3移植的δ2链mRNA共转染到抗CD3抗体刺激的PBMC,制备CDR3δ2基因修饰型γδT淋巴细胞,研究其抗肿瘤作用。方法通过PCR扩增含有肿瘤反应性特异CDR3δ2序列(OT3和OT10)的TCRδ2链及γ9链,构建重组质粒p GEM4Z/δ2(OT3)/A64、p GEM4Z/δ2(OT10)/A64和p GEM4Z/γ9/A64;以线性化的重组质粒作为模板,体外合成δ2(OT3)、δ2(OT10)和γ9 mRNA;将δ2(OT3)mRNA和δ2(OT10)mRNA分别与γ9 mRNA共电转染入抗CD3抗体刺激的正常人PBMC;经流式细胞术检测和分选γ9δ2(OT3)T细胞和γ9δ2(T10)T细胞。ELISA及MTT法分别检测上述转染细胞的抗肿瘤作用。结果 CDR3δ2基因修饰的TCRγδ细胞γ9δ2(OT3)T细胞和γ9δ2(T10)T细胞能够分泌较高的IFN-γ及TNF-α(P<0.05),对多种肿瘤细胞具有显著的细胞毒作用(P<0.05)。结论基因修饰型γ9δ2 T细胞能够明显增强对肿瘤的杀伤活性,为肿瘤过继免疫细胞的制备提供了新的策略。

mRNA电转抗CD3抗体刺激的PBMC方法的建立

目的建立信使RNA(mRNA)电转抗CD3抗体刺激的外周血单个核细胞(PBMC)的方法,为制备基因修饰CDR3δ移植型γδT淋巴细胞,为肿瘤细胞过继治疗提供新的技术方法。方法以SpeⅠ内切酶消化重组p GEM4Z/EGFP/A64质粒,回收纯化线性化的重组质粒p GEM4Z/EGFP/A64,体外转录成mRNA;在电转参数为500 V500μs、400 V 500μs或300 V 500μs等不同条件下,转染抗CD3抗体刺激的人PBMC;用倒置荧光显微镜观察和流式细胞仪观察和分析绿色荧光蛋白的表达;台盼蓝染色计算不同电转条件下细胞的存活率,以确定mRNA电转最佳条件。结果 p GEM4Z/EGFP/A64质粒经过SpeⅠ内切酶酶切,获得了线性化的质粒;体外转录得到了增强型绿色荧光蛋白(EGFP)mRNA;与其他转染条件相比,在500 V 500μs电转参数下转染EGFP mRNA的PBMC细胞,电转后48 h绿色荧光蛋白表达量较高;与其他转染条件相比,在500 V 500μs电转参数下转染EGFP mRNA的PBMC细胞,电转48 h后绿色荧光蛋白表达的阳性细胞高达77%;台盼蓝染色分析不同电转条件下细胞的存活率,在细胞电转48 h后,500 V 500μs参数电转条件下细胞存活率可以达到85%以上。结论电转参数为500 V 500μs的条件可用于电转mRNA于抗CD3抗体扩增的人PBMC,以制备基因修饰T淋巴细胞。

柴胡加龙骨牡蛎汤等经方治疗抑郁症的动物行为学研究

目的 :在抑郁症动物模型的基础上 ,研究经方治疗抑郁症的动物行为学改变。方法 :根据临床采用柴胡加龙骨牡蛎汤、甘麦大枣汤、百合地黄汤等经方治疗抑郁症的实践 ,观察其对小鼠强迫游泳的不动时间的影响。在此基础上又采用慢性应激的大鼠模型 ,对柴胡加龙骨牡蛎汤进行了行为学研究。结果 :(1)柴胡加龙骨牡蛎汤大、小剂量 ,甘麦大枣汤小剂量 ,百合地黄汤大剂量 ,盐酸氯丙咪嗪等均能明显缩短小鼠强迫游泳的不动时间 ,其中柴胡加龙骨牡蛎汤小剂量作用最为显著。而甘麦大枣汤大剂量、百合地黄汤小剂量 ,对小鼠强迫游泳的不动时间无显著影响。 (2 )慢性应激模型组大鼠与正常组比较 ,水平运动次数与垂直运动次数均明显减少 ,差异极显著 ;柴胡加龙骨牡蛎组的水平运动、氯丙咪嗪组的垂直运动同模型空白组比较 ,均有极显著差异 ;柴胡加龙骨牡蛎组的垂直运动、氯丙咪嗪组的水平运动同模型空白组比较 ,均有显著性差异。结论 :小鼠强迫游泳试验表明 ,柴胡加龙骨牡蛎汤、甘麦大枣汤、百合地黄汤等经方均有抗抑郁作用 ,其中柴胡加龙骨牡蛎汤作用更为显著。采用慢性应激的大鼠模型进一步证实 ,柴胡加龙骨牡蛎汤具有抗抑郁作用。结合以上经方的临床作用 ,说明在抑郁症动物模型基础上的动物试验 ,是筛选和证实中药复方抗?

一种对阿尔茨海默病模型小鼠认知和记忆功能具有明显改善作用的中药方剂

目的 :探索对阿尔茨海默病 (AD)病人认知和记忆能力具有明显改善作用的中药方剂。方法 :通过Balb/c小鼠侧脑室微量注射聚集态 β 淀粉样多肽 (β AP2 5 35) ,建立模拟AD的小鼠动物模型 ,并通过行为学实验和脑组织组织化学检测 ,研究了中医经典药方柴胡加龙骨牡蛎汤、当归芍药散和作者自己研制的两种中药复方CHPI和CHPⅡ对该小鼠模型认知和记忆能力的疗效作用。同时 ,以西药脑复康做对照。结果 :CHPⅡ对AD模型小鼠的认知和记忆能力具有明显的改善。结论

柴地合方对慢性应激抑郁模型大鼠免疫功能的影响

目的 :观察柴地合方对慢性应激抑郁模型大鼠多种免疫功能的影响 ,探讨其抗抑郁作用可能的部分机理。方法 :以多种复合刺激交替进行的方法建立慢性应激抑郁模型 ,并取脾脏进行淋巴细胞体外培养。称量脾脏和胸腺重量测定胸腺指数和脾指数 ,以3 H胸腺嘧啶 (3 H TdR)掺入法检测T、B淋巴细胞增殖 ,以放射免疫法测定体外培养淋巴细胞的白介素 1β(IL 1β)和白介素 6 (IL 6 )分泌水平。结果 :(1)慢性应激大鼠的胸腺指数和脾指数减小 ,T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖受到抑制 ,IL 1β 和IL 6分泌水平降低 ,提示慢性应激大鼠的免疫功能受到抑制。 (2 )柴地合方治疗可使慢性应激大鼠受抑制的免疫功能得到改善 ,对慢性应激导致的病理性免疫功能抑制具有增强作用 ,而氯丙咪嗪对其没有显著改变。结论 :柴地合方可逆转慢性应激大鼠免疫功能的抑制状态 ,这可能是其抗抑郁作用的机理之一 ,并与氯丙咪嗪作用机理可能不同。

中药复方CHPⅡ对PDAPP^(V717I)转基因小鼠脑组织病变的影响

目的 研究中药复方 (CHPII)对PDAPPV71 7I转基因小鼠脑组织内病理改变的影响。 方法 通过免疫组织化学染色检测CHPⅡ对PDAPPV71 7I转基因小鼠脑组织内淀粉样蛋白沉淀和反应性星形胶质细胞活化程度的影响。 结果 CHPⅡ治疗组PDAPPV71 7I转基因小鼠脑组织内淀粉样蛋白沉淀的水平明显低于对照组和脑复康组 ,反应性星形胶质细胞的活化程度也明显降低。 结论 CHPⅡ能够明显降低PDAPPV71 7I转基因小鼠脑组织内淀粉样蛋白沉淀 ,降低脑组织内的神经炎症反应。

桂枝加厚朴杏子汤加味浸膏对小鼠免疫功能的影响

目的 观察桂枝加厚朴杏子汤加味浸膏对小鼠免疫功能的影响。方法 采用小鼠慢性给药,观察免疫器官重量、淋巴细胞变化。结果 桂枝加厚朴杏子汤加味使胸腺指数、脾脏指数均降低,明显抑制胸腺、脾脏生长;并且能明显抑制PHA、LPS诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应。结论 本方对细胞免疫和体液免疫均有抑制作用。

人白细胞介素-15 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从正常人外周血中分离粘附的单核细胞，加入ＬＰＳ刺激４ｈ后提取细胞ｍＲＮＡ反转录获得ｃＤＮＡ第一链，用两对特异引物进行巢式ＰＣＲ扩增出含ＢａｍＨＩ酶切位点的编码人１Ｌ－１５成熟蛋白的ｃＤＮＡ，其大小约３６０ｂｐ。用ＰＥＧ法回收其片段并将其连接到ｐＢＳＳＫ载体的ＳｍａⅠ位点上进行序列分析，结果表明其序列与文献报道一致。然后再将其片段亚克隆插入到ｐＧＥＸ－２Ｔ的ＢａｍＨＩ位点。筛选插入方向正确的克隆，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，以１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导５ｈ收集菌体直接进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，与阴性对照相比，ＭＷ４４ＫＤ处多出一条带，紫外扫描显示此带占菌体蛋白总量的８．８％。ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实此带能够特异地与兔抗人ＩＬ－１５的抗体发生反应。证明ＲＴ－ＰＣＲ所得的人ＩＬ－１５ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得了表达，为进一步探讨人ＩＬ－１５的生物学作用打下基础。

昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白及其生物学功能的初步鉴定

目的建立昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白技术平台并鉴定其表达产物的生物学功能。方法用搭桥PCR获得γ9Fc和δ2(OT3)Fc基因片段,构建成pBACp10ph-γ9/δ2(OT3)-Fc重组质粒,与AcNPV昆虫病毒DNA共转染昆虫sf9细胞,表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白;Western blot鉴定TCRγ9/δ2-Fc蛋白表达位置;胞内流式细胞仪检测γ9Fc和δ2(OT3)Fc两基因表达效率;蛋白G亲和层析后,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度;激光共聚焦扫描显微镜技术和生物传感器技术检测了TCRγ9/δ2-Fc蛋白与SKOV3细胞和MNS蛋白的结合特性。结果成功构建pBACp10ph-γ9/δ2(OT3)-Fc表达载体,经鉴定发现TCRγ9/δ2-Fc蛋白在sf9细胞内表达,但γ9Fc和δ2(OT3)Fc两基因的表达效率有较大差异。纯化得到一定纯度的TCRγ9/δ2-Fc蛋白,并且具有与SKOV3细胞和MNS蛋白结合的特性。结论成功建立昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白的技术平台,表达产物TCRγ9/δ2-Fc可以在体外模拟TCRγδ识别抗原的特性。

加快西部地区城镇化发展对策思考

城镇化成为十八大之后最重要的发展问题之一,中央经济工作会议提出"积极稳妥推进城镇化,着力提高城镇化质量"。中央经济工作会议明确了今后城镇化的路径不再是以城镇化速度和城市扩张,而是着力提升城镇化的质量。高质量的城镇化是以人为核心的城镇化,改变了过去城镇化过程中只注重速度而忽视质量,真正体现了城镇化的核心本质。本文总结了西部地区城镇化发展历程与目前西部地区城镇化面临的问题,为西部地区如何走出一条高质量城镇化之路从城乡体制、财税政策等方面提出了对策建议。

不同治疗剂量白细胞介素2对人外周血γδT细胞增殖和表型的影响

目的研究治疗剂量范围内白细胞介素2(IL-2)对T细胞的增殖作用,特别是对人外周血γδT细胞数量和功能亚群的影响。方法采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,在不同浓度IL-2作用下培养2周,利用免疫荧光染色和流式细胞术分析培养前后不同淋巴细胞的表型和比例,采用台盼蓝染色和血球计数法进行细胞计数。结果Vδ1和Vδ2型γδT细胞的4个功能亚群中,CD27+细胞(包括CD27+CD45RA+和CD27+CD45RA-)可以表达淋巴组织归巢受体CCR7,CD27-细胞(包括CD27-CD45RA+和CD27-CD45RA-)不表达CCR7,具有分布于外周组织的潜能;各个γδT细胞的功能亚群均能表达活性相关受体,在丝裂原刺激下可以迅速产生不同水平的细胞毒作用相关效应分子。虽然高剂量IL-2对CD4 T细胞的增殖产生抑制作用,但对γδT的增殖反而有促进作用,增殖的γδT细胞以CD27-CD45RA-的效应细胞为主。结论治疗剂量范围内的IL-2具有刺激人外周血γδT细胞增殖的作用,在基于IL-2的抗肿瘤治疗中可能具有重要的生物学意义。

脉炎消注射液的免疫学实验研究

脉炎消注射液可在体外抑制ＰＨＡ诱导的健康人外周血淋巴细胞的增殖反应，对健康人外周血单个核细胞有直接的毒性杀伤作用，其中受作用的细胞主要为ＣＤ１９＋Ｂ细胞和ＣＤ４＋Ｔ细胞；脉炎消注射液还可抑制ｓＲＢＣ免疫小鼠ＩｇＭ型抗体生成细胞的产生及降低ｓＲＢＣ免疫小鼠的脾脏重量。

TCRγ9/δ2(OT3)-Fc融合蛋白体内抗肿瘤效果研究

目的:研究TCRγ9/δ2(OT3)-Fc融合蛋白在体内抗肿瘤效果。方法:通过同位素99mTc标记技术观察TCRγ9/δ2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内的显像和分布,观察TCRγ9/δ2(OT3)-Fc对荷瘤裸鼠肿瘤生长和生存期的影响。结果:在荷瘤裸鼠体内99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc与肿瘤组织有明显的结合,并且其可抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长速度,延长小鼠生存期。结论:本研究初步证实TCRγ9/δ2(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内有一定的抗肿瘤效果,为肿瘤靶向性抗体治疗提供了新的思路。

小鼠胸腺雄激素受体的定位及其与新分子Rwdd1的关系

目的研究雄激素受体(AR)在胸腺萎缩中的作用机制。方法用免疫组化和RT-PCR观察AR在小鼠胸腺内的分布;用刀豆蛋白A(ConA)诱导胸腺细胞增殖,观察睾酮对细胞增殖的影响;构建AR和Rwdd1的真核表达载体pcDNA3.1-AR和pcDNA3.1-Rwdd1-V5,共转染293T细胞,通过免疫共沉淀(CoIP)法观察二者之间在细胞内是否存在相互作用。结果AR广泛分布在胸腺皮质和髓质,且主要定位于胞核。在不同胸腺细胞亚群中均有AR表达,其中以CD4-CD8-(DN)细胞表达水平最高。3种胸腺上皮细胞系中仅皮质来源的427.1细胞系存在AR表达。胸腺细胞中存在功能性AR。AR与Rwdd1之间不存在直接相互作用。结论小鼠胸腺细胞中存在AR的表达,目前尚不能证明AR与Rwdd1存在直接的相互作用。

桂枝加厚朴杏子汤加味对过敏性哮喘豚鼠肿瘤坏死因子α、内皮素1的影响

采用过敏性哮喘豚鼠模型 ,以肿瘤坏死因子α(TNF α)、内皮素 1(ET 1)作为观测指标 ,对桂枝加厚朴杏子汤加味浸膏治疗哮喘的免疫机制进行了研究。结果 :桂枝加厚朴杏子汤加味能够抑制血浆和支气管肺泡灌洗液 (BALF)中的ET 1及BALF中的TNF α的水平 ;减少TNF α、ET 1的分泌产生 ,可以减轻气道的炎症反应 ,降低气道高反应性 (AHR)。这可能是本方治疗哮喘的重要机制之一。

正常人 TCRγδ细胞系的建立及功能研究

本文以抗 Ｔ Ｃ Ｒγδ单克隆抗体固相法体外选择性扩增获得１０ 例高纯度（８４２ ％ ±５８ ％ ） 正常人 Ｔ Ｃ Ｒγδ细胞系。在体外功能研究时发现， 植物血凝素（ Ｐ Ｈ Ａ） 、结核分枝杆菌（ Ｍｔｂ ） 、阴道毛滴虫（ Ｔ Ｖ） 和人类６ 型疱疹病毒（ Ｈ Ｈ Ｖ６ ） 的刺激对已处于高增殖和高肿瘤细胞（ Ｄａｕｄｉ 细胞） 细胞毒活性状态的 Ｔ Ｃ Ｒγδ细胞已无进一步增强活性的影响。结果表明， 抗体刺激已使γδ细胞处于活化状态， 其细胞增殖和细胞毒活性无需抗原的再刺激即可得到很好的维持。提示 Ｔ Ｃ Ｒγδ单抗活化的γδ Ｔ 细胞可能成为肿瘤过继治疗的一种候选效应细胞。抗体活化的γδ Ｔ细胞本身具有分泌 Ｉ Ｌ２ 和 Ｉ Ｎ Ｆγ的能力。在抗原刺激的条件下， 细胞内感染的微生物（ Ｍｔｂ 和 Ｈ Ｈ Ｖ６ ） 刺激γδ Ｔ细胞产生 Ｔｈ１ 型细胞因子（ Ｉ Ｌ２ 和 Ｉ Ｎ Ｆγ） ； 而细胞外感染病原体 Ｔ Ｖ的刺激则无明显增加γδ Ｔ 细胞的 Ｔｈ１ 型细胞因子分泌。这一结果提示， 在抗胞内病原体中， γδ Ｔ 细胞可控制 Ｔｈ１ 细胞反应性炎症的发生与发展。

自身免疫病患者外周血γδT细胞系的功能研究

目的 研究自身免疫病人外周血TCRγδ细胞系在微生物及寄生虫抗原刺激下细胞因子的分泌情况。方法 以TCRγδ单克隆抗体固相法体外选择性扩增获得7例胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)及3例类风湿性关节炎(RA)病人外周血TCRγδ细胞系,平均纯度可达(847±59)%。在体外培养条件下,以植物血凝素(PHA)、结核分枝杆菌(M.tb)、阴道毛滴虫(TV)、人类6型疱疹病毒(HHV6)刺激24h及48h后,测定细胞因子分泌情况。结果 HHV6刺激组IL2的分泌量显著高于其它各实验组;M.tb及HHV6的刺激可导致IFNγ的高产量。TNFα的产生未见有显著性差异。结论 γδT细胞可能通过细胞因子的产生来影响自身免疫病的发生与发展。