南方水稻黑条矮缩病毒P7-2基因的克隆与原核表达

【目的】为克隆获得南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的P7-2基因并实现其原核表达。【方法】利用RT-PCR技术从感染SRBSDV的水稻叶片中扩增出P7-2基因。利用Gateway重组技术将基因P7-2整合到原核表达载体pDEST17上,获得重组原核表达载体pDEST17-P7-2。随后将原核表达载体pDEST17-P7-2转化到原核表达菌株Rosetta中。利用IPTG诱导P7-2蛋白表达并优化其诱导条件。【结果】利用RT-PCR技术扩增得到基因P7-2,其大小为930 bp。测序结果表明获得原核表达载体pDEST17-P7-2。菌液PCR鉴定了原核表达阳性菌株。在温度为28℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L诱导表达8 h,可获得大量大小约为42 kDa含HIS标签的融合蛋白。【结论】克隆获得了SRBSDVP7-2的基因序列,实现了该基因的原核表达并探索其最佳诱导条件,为南方水稻黑条矮缩病的田间诊断、预测预报及P7-2的功能研究奠定了基础。

利用酵母双杂交系统筛选本氏烟中与RGSV P5互作的蛋白

【目的】水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的,给粮食产量造成了严重威胁。RGSV P5是该病毒的沉默抑制子,在抵抗寄主RNA沉默中发挥重要作用。筛选、鉴定与水稻草状矮缩病毒(RGSV)沉默抑制子P5互作的寄主蛋白,为揭示水稻草状矮化病毒致病的分子机制提供理论基础,为该病毒病的防治提供有效策略。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与水稻草状矮化病毒P5互作的寄主蛋白。提取感染水稻草状矮化病毒的水稻叶片的总RNA。依据P5基因的CDS序列设计特异性引物。利用RT-PCR技术获得P5基因,将P5基因构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7上,利用双酶切鉴定诱饵质粒。将诱饵载体pGBKT7、pGBKT7-P5、重组质粒pGBKT7-P5/pGADT7分别转化到酵母感受态细胞Y2H Gold中,通过观察其在缺陷培养基SD/-Trp、SD/-Leu-Trp/上的生长情况及在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上的显色情况检测诱饵质粒的毒性和自激活活性。将烟草酵母cDNA文库质粒转化到含诱饵载体pGBKT7-P5的酵母感受态细胞中,先后用不同缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal筛选后获得阳性克隆。经酵母质粒提取、转化、测序和Blast等分子生物学方法最终获得互作蛋白的序列。【结果】RT-PCR扩增得到P5基因,其大小为576 bp。成功构建诱饵载体pGBKT7-P5。表达的诱饵蛋白P5对酵母菌没有毒性和自激活活性。诱饵蛋白P5从本氏烟酵母cDNA文库中进行大量筛选,获得15个阳性克隆,分析后最终得到7个与P5互作的本氏烟蛋白。经生物信息学分析它们分别为线粒体孔蛋白VDAC、ADP核糖基化因子GTP水解酶激活蛋白ArfGAP、囊泡突触结合蛋白Syt-2、延伸因子eEF1A、脯氨酸合成酶共转录的细菌同源蛋白PROSC、非特征蛋白C9orf78及一种未知蛋白。【结论】本研究成功筛选到7个与水稻草状矮化病毒P5互作的寄主因子。这些互作的寄主因子主要参与转运、生物或非生物胁迫、胁迫应答等生物学过程。深入研究这些互作因子将为解析寄主蛋白参与调控病毒的复制、运动、致病等分子机制提供理论基础,为水稻草状矮化病毒病的防治提供新的思路。

水稻草状矮化病毒和水稻锯齿叶矮缩病毒的分子检测

【目的】明确采自福州水稻基地中水稻的病毒种类,为生产上有效防控水稻病毒病提供科学依据。【方法】从福建省福州市仓山区水稻基地采集有矮缩、黄化、分蘖增多等症状的水稻样品共9株,采用RT-PCR方法对其病原进行鉴定。根据水稻草状矮化病RGSV P6和水稻锯齿叶矮缩病RRSV P10的基因序列分别设计一对特异性引物,提取感病水稻样品和健康水稻叶片的总RNA,并进行RT-PCR扩增和测序。【结果】在9株水稻样品中,均扩增到500 bp左右的片段,与RGSV预期片段大小一致;有1株同时扩增到750 bp左右的片段,与RRSV预期片段大小一致,而健康水稻中均未扩增到相关条带。【结论】水稻病毒田间的毒源种类比较多,也常常出现复合侵染和隐症现象,因此仅通过病害症状表现很难诊断病毒病,需借助分子生物学手段才能作出正确的诊断。RT-PCR鉴定结果表明采集的9株矮缩水稻样品均感染RGSV,有一株复合感染RRSV。水稻病毒病病原的鉴定将为水稻病害的防治提供参考依据。