帕金森病发病机制的研究进展

帕金森病（PD）是一种中老年人常见的进行性中枢神经系统退行性疾病,患病率为160/10万,主要病变为中脑黒质致密部（SNpc）多巴胺能神经元退行性病变导致的多巴胺（DA）与乙酰胆碱平衡失调。其病理特点是中脑黑质多巴胺能神经元严重的变性、缺失,残存的神经元内出现parkin、DJ-1、

散发性帕金森病蛋白酶体功能障碍及其所致的路易(小)体形成

散发性帕金森病(sporadic Parkinson's disease,sPD)的主要病理特征之一是中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)残存多巴胺能神经元内核周路易(小)体(Lewy body,LB)形成.LB发生的具体原因和确切过程有待进一步阐释.来自遗传学、尸体解剖和实验科学的报道提示,蛋白酶体功能障碍及其所致的LB形成可能是按照聚集体形成途径(process of aggresomes)进行的.在聚集体形成途径过程中,异常蛋白质聚集基本上经历了非纤维化分子聚集过程(molecular crowding)以及后续的纤维化聚集过程(fibrilation of aggregation).其间,蛋白酶体功能障碍(dysfunction of proteasome)、内质网相关降解丧失(loss of endoplasmic reticulum associated degradation)、非纤维化聚集物(nonfibrilar aggregates)、聚集体(aggresomes)及至纤维化LB(fibrilar LB)等构成了sPD病变过程的主要事件.这提示在sPD病变过程中,蛋白酶体功能障碍及其所致的LB形成过程实质上是细胞信号的转导过程,其间涉及了众多的蛋白质分子.

NGF诱导PC12细胞早期分化的DIGE分析

目的筛选神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)处理后PC12细胞分化早期相关蛋白,寻找NGF药物作用靶点,为深入进行神经保护药物的研发提供理论依据。方法在建立NGF诱导PC12细胞分化模型的基础上,分别提取NGF处理前后的细胞总蛋白,应用荧光差异凝胶电泳(Differential Gel Electrophoresis,DIGE)系统获得蛋白点表达差异信息,运用MALDI-TOF质谱鉴定出差异蛋白质。结果NGF处理组有7个蛋白点发生变化;通过数据库检索,鉴定了3种结构和功能各异的蛋白。结论eEF-2、Rab GDIα和DPP与NGF诱导PC12细胞分化早期过程有关,可能是NGF的作用靶点。

PPARγ基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的相关性研究

目的探讨PPARγ基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗死的关系。方法本研究共纳入227例动脉粥样硬化性脑梗死患者和404例健康对照人群。以rs1875796为遗传标记,应用多聚酶链-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术检测PPARγ基因rs1875796的个体基因型。结果女性动脉粥样硬化性脑梗死组rs1875796的C等位基因频率较对照组明显增高（χ2=9.113,P=0.003,OR=2.211,95%CI1.321～3.700）,女性动脉粥样硬化性脑梗死rs1875796位点的CC＋CT基因型频率较对照组明显增高（χ=8.032,P=0.005,OR=2.404,95%CI1.310～4.411）,经过多因素回归分析调整了传统危险因素的影响,两组间仍有显著性差异（P=0.006）。而男性动脉粥样硬化性脑梗死组与对照组rs1875796的等位基因、基因型频率差异无显著意义。结论PPARγ基因可能与女性动脉粥样硬化性脑梗死相关。

体外诱导SH-SY5Y细胞凋亡的氧糖剥离再灌注模型的建立及评价

目的:通过体外模拟缺血-再灌注损伤(I/R)诱导细胞凋亡的氧糖剥离再灌注(OGD/R)模型的建立与评价,探讨成功诱导神经元凋亡发生的可靠时间窗,为进一步阐明神经元凋亡机制奠定基础。方法:选用人神经母细胞瘤系SH-SY5Y细胞分为对照组和实验组,实验组给予不同的OGD/R时间,通过MTT法计算细胞存活率,选定再灌注24h存活率接近50%的OGD10h/R组和对照组细胞,通过光镜、荧光显微镜及电镜观察细胞形态学改变,采用试剂盒检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)水平、胞浆内丙二醛(MDA)含量及细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活力,流式细胞术检测细胞周期和凋亡率。结果:MTT法结果显示,细胞存活率随OGD时间延长显著降低,OGD10h/R24h组为对照组的(44.91±1.21)%,不同OGD/R时间组间细胞存活率比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。倒置显微镜及HE染色显示,OGD10h/R组细胞密度减低,形态多样性,核固缩;AO/EB荧光染色可见凋亡小体形成,电镜显示核内异染色质凝集、趋边等凋亡的改变。实验组培养液内LDH水平及胞浆内MDA含量随再灌注时间延长而增加,LDH水平于再灌注24h达峰值,MDA含量于再灌注24h接近平台期,胞浆内SOD活性随再灌注时间延长呈现先降低后回升的趋势,与相同时间对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。流式细胞术检测细胞周期显示,随再灌注时间延长,OGD10h/R组G0/G1期细胞比例逐渐增加,24h达峰值(74.09±2.62)%,其后有所降低,G2/M期细胞比例再灌注0h时最高达(26.85±1.35)%,此后逐渐降低,24h前均显著高于同时间对照组细胞,S期细胞比例逐渐降低,24h最低达(19.2±1.58)%,此后逐渐升高,与同时间对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:体外模拟I/R模型的OGD10h/R组能够成功诱导SH-SY5Y细胞凋亡的发生,可进一步应用于凋亡机制的研究。

多巴胺诱导SH-SY5Y细胞帕金森病模型中GRP78的表达

目的:探讨神经毒素多巴胺(DA)诱导SH-SY5Y细胞帕金森病(PD)细胞模型中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的表达,为深入研究PD的发病机制提供理论依据。方法:建立多巴胺诱导SH-SY5Y细胞帕金森病模型,实验组加入DA(溶解于0.2%维生素C,DA终浓度为200μmol.L-1),对照组加入等体积的0.2%维生素C,分别孵育24h,台盼蓝染色检测细胞存活率,Hoechst33342染色检测细胞凋亡。分别提取实验组和对照组细胞总蛋白,应用荧光差异双向凝胶电泳(DIGE)技术获得蛋白点的差异表达,应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)鉴定差异蛋白质。结果:实验组细胞存活率为53.2%,与对照组细胞存活率(100%)比较显著下降(P<0.05)。荧光染色,实验组可见细胞核呈固缩状或碎裂状,呈典型的凋亡形态学改变;对照组可见细胞胞核着均匀一致蓝色。DIGE分析,实验组表达增高的一个蛋白质点,经质谱分析鉴定确认为GRP78。结论:多巴胺能够诱导SH-SY5Y细胞凋亡,凋亡过程中GRP78表达增高,提示GRP78增高可能与PD的发病机制有关。

环氧合酶基因多态性与缺血性卒中相关性研究

目的通过病例对照研究,探讨环氧合酶基因(PTGS2)多态性与缺血性卒中的关系。方法本研究共纳入572例缺血性卒中患者和253例对照组人群,以位于PTGS2基因的rs689466位点为遗传标记,采用聚合酶链反应(PCR)和限制性片断长度多态性(RFLP)技术检测PTGS2基因的多态性。结果缺血性卒中组和对照组的rs689466位点等位基因、基因型频率差异无统计学意义(P>0.05);将病例组进行分层分析后,血栓型脑梗死组、腔隙性脑梗死组、合并血管狭窄的缺血性卒中组的rs689466位点的等位基因、基因型频率与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论环氧合酶基因与缺血性卒中的发病可能无关。

鱼藤酮与帕金森病

帕金森病（PD）是一种常见的影响中老年人运动功能的中枢神经系统慢性变性疾病。临床表现为静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势步态异常等。病理特征为黑质多巴胺（DA）能神经元缺失、残存神经元内出现路易小体（LB）。至今散发性PD的病因不清。流行病学调查提示环境因素中的杀虫剂接触可能是PD潜在的危险因素,经常接触农药的人群PD患病率明显高于非暴露人群。鱼藤酮作为一种自然存在的化合物,自20世纪40年代以来一直是最广泛应用于农业除害和鱼塘清理的杀虫剂。近年来的研究发现,鱼藤酮可能对机体神经系统的功能产生影响,尤其是与PD之间可能存在潜在联系。

钙激活蛋白酶与蛋白酶体抑制剂诱导细胞凋亡的机制

目的探讨蛋白酶体抑制剂诱导PC12细胞凋亡的作用通路,为深入研究泛素-蛋白酶体系统(UPS)功能障碍诱发细胞凋亡发病机制提供新线索。方法建立PSI诱导的PC12细胞模型,在48h提取蛋白,应用荧光差异凝胶电泳(DIGE)系统获得差异蛋白点,运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOFProMS)鉴定出差异蛋白。结果实验组与对照组比较,在48h看到细胞凋亡(细胞核呈固缩状或碎裂状),凋亡率达14.86%。实验组钙激活蛋白酶(calpain)与对照组比较表达量显著增高,有统计学意义(P<0.05)。结论首次发现在蛋白酶体抑制PC12细胞模型中calpain蛋白表达显著增高。结合GRP78和GRP94表达上调的发现提示内质网应激(ERS)在UPS功能障碍引起细胞凋亡过程中扮演重要角色。

MPTP/MPP^+诱导的帕金森病实验模型的研究进展

建立一个稳定可靠的实验模型对研究帕金森病(PD)的发病和治疗是尤其必要的。自从发现1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)能在人类诱发PD以来,人们对其神经毒性作了大量研究。MPTP及其有效成分1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)对中脑黑质多巴胺能神经元有选择性的破坏作用,从而发挥其诱导PD的毒性作用。在过去的几十年里对MPTP/MPP+诱导的PD实验模型的研究取得了显著的进展,目前MPTP/MPP+诱导的PD实验模型已广泛地用于PD研究。

帕金森病路易(小)体的蛋白质生物信息学数据分析

原发性帕金森病(idiopathic Parkinson's disease,PD)的主要病理特征之一是出现于中脑特定脑区黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺能神经元的路易(小)体(Lewy bodies,LBs),PD病人LBs和/或路易轴突也出现于脑内其他脑区非多巴胺能神经元,比如蓝斑(locus coeruleus,LC)等脑干个别脑区去甲肾上腺素能神经元、额前叶皮层(prefrontal cortex,PFC)、颞叶皮层(temporal cortex,TC)等大脑多个脑区胆碱能神经元.为了明确LBs的蛋白质构成,本文通过蛋白质生物信息学数据分析,就LBs的蛋白质构成归纳了5个方面的要点:a.LBs的组织结构单元是α-突触核蛋白(α-synuclein,α-SYN)表征的2类纤维状聚集物和6类非纤维状聚集物(通常被称为寡聚物);b.病理性α-SYN在LBs内存在5种化学修饰形式;c.19个α-SYN相关蛋白质分别与α-SYN共定位于LBs;d.117个LBs的已知蛋白质被划分为10组不同蛋白质功能群组;e.LBs的蛋白质组学鉴定数据库包含了分别在LC、SNpc和PFC脑区组织水平鉴定的84、124和120个候选蛋白质,在TC脑区细胞水平鉴定的108个候选蛋白质,以及在TC脑区亚细胞水平鉴定的29个候选蛋白质.上述要点广泛、深入地概括了LBs的蛋白质构成.

6-羟基多巴胺诱导SH-SY5Y细胞帕金森病模型中Peroxiredoxin6表达的研究

目的应用蛋白质组学技术研究6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导SH-SY5Y细胞帕金森病(PD)模型中Peroxiredoxin6(Prx6)的表达变化。方法在建立6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞帕金森病模型的基础上,分别提取6-OHDA实验组和对照组孵育24h的细胞总蛋白,应用荧光差异双向凝胶电泳(DIGE)技术获得蛋白点的差异表达信息,运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)鉴定出差异蛋白质。结果DIGE分析发现实验组有一个表达明显上调的差异蛋白质点(P<0.01),经质谱分析鉴定确认为Prx6。结论6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞的帕金森病模型中Prx6表达上调,提示PD中有氧化应激存在,Prx6上调及氧化应激可能与PD的发病机制有关。

6-羟基多巴胺诱导PC12细胞帕金森模型中GRP78表达的研究

目的探讨神经毒素6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导PC12细胞的帕金森(PD)模型中GRP78的表达。方法在建立6-OHDA诱导PC12细胞帕金森模型的基础上,MTT法测细胞存活率和Hoechst33342染色检测细胞凋亡。分别提取6-OHDA处理组和对照组细胞总蛋白,应用荧光差异凝胶电泳(Differentia Gel Electrophoresis,DIGE)技术获得蛋白点的差异表达信息,运用MALDI-TOF质谱鉴定出差异蛋白质。结果实验组细胞存活率为60%±4.8%,与对照组比较显著下降(P<0.05)。荧光染色可见细胞核呈固缩状或碎裂状的典型的凋亡形态学改变。DIGE分析发现6-OHDA组表达明显增高的一个蛋白质点,经质谱分析鉴定确认为GRP78。结论6-OHDA能够诱导PC12细胞凋亡,凋亡过程中GRP78表达增高,提示GRP78增高可能与PD的发病机制有关。

6-羟基多巴胺诱导SH-SY5Y细胞帕金森病模型中14-3-3蛋白表达的研究

目的应用蛋白质组学技术研究6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导SH-SY5Y细胞帕金森病(PD)模型中14-3-3蛋白的表达变化。方法在建立6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞PD模型的基础上,分别提取6-OHDA实验组和对照组孵育24h的细胞总蛋白,应用荧光差异双向凝胶电泳(DIGE)技术获得蛋白点的差异表达信息,运用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)鉴定出差异蛋白质。结果DIGE分析发现实验组有一个表达明显上调的差异蛋白质点(P<0.05),经质谱分析鉴定确认为14-3-3蛋白。结论6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞的PD模型中14-3-3蛋白表达上调,提示14-3-3蛋白上调可能与PD的发病机制有关。

Aβ_(25-35)诱导PC12细胞损伤的蛋白质组学研究

目的识别AD细胞模型中蛋白质组改变,在蛋白质水平上揭示Aβ的作用机制。方法利用双向差异凝胶电泳技术(2D-DIGE)和质谱(MS)技术,探索20μmol/L浓度Aβ25-35肽段作用48h后PC12细胞蛋白质组的改变。结果2D-DIGE图像上出现约2000个蛋白点。与对照组比较,Aβ25-35作用下共有29个蛋白的表达有显著差异,其中25个蛋白表达量上调及4个蛋白表达量下调超过30%。质谱鉴定出7个蛋白点,分为3类:(1)具有分子伴侣活性的蛋白:葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein75,GRP75)、热休克同源蛋白71(heat shock cognate71kDa protein,HSC71)、calreticulin表达量均上调。(2)细胞骨架蛋白:β-微管蛋白(tubulin beta chain15,TBETA-15)和低分子量神经细丝蛋白(neurofilament light polypeptide,NF-L)表达量亦上调。(3)与能量代谢有关的酶:肌酸激酶B(creatine kinase-B,CKB)和醛缩酶A(aldolaseA)蛋白表达量均下调。结论本实验首次将DIGE和MS方法应用于Aβ25-35神经毒性作用机制研究,在蛋白质组水平上揭示了Aβ25-35毒性作用的早期机制。

雷沙吉兰(Rasagiline)对Aβ_(25-35)诱导PC12细胞凋亡的防护作用

目的探讨雷沙吉兰(Rasagiline)对β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导PC12细胞损伤阿尔茨海默病(AD)模型的保护作用及其机制。方法不同浓度的Aβ25-35(1μmol/L,10μmol/L,20μmol/L)作用于PC12细胞48h,MTT法检测细胞存活率,选用使细胞存活率降低到64%的Aβ浓度20μmol/L。用不同浓度的雷沙吉兰(0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L)预孵育PC12细胞1h,再加入20μmol/L的Aβ共孵育48h,再测MTT活性,并用荧光染料丫啶橙和溴化乙啶染色,在荧光显微镜下计数凋亡细胞检测凋亡细胞百分率。结果Aβ在20μmol/L时使PC12细胞存活率降低至64%,与对照组差异显著,1μmol/L的雷沙吉兰可显著提高细胞存活率至85%。对照组细胞凋亡率为2%,20μmol/L Aβ作用48h后,PC12细胞凋亡率达13%,1μmol/L的雷沙吉兰使20μmol/L Aβ诱导的PC12细胞凋亡率下降到5%。结论雷沙吉兰对Aβ引起的PC12细胞损伤具有明显的保护作用,其机制可能与抑制Aβ诱导的凋亡有关。

NOS3基因多态性与合并高血压病的缺血性卒中关系的研究

目的探讨NOS3基因多态性与合并高血压病的缺血性卒中的关系。方法以rs1800780位点为遗传标记,采用聚合酶链反应（PCR）和限制性片断长度多态性（RFLP）,检测605例缺血性卒中患者和313例对照组人群NOS3基因的多态性。结果缺血性卒中组和对照组的rs1800780位点等位基因、基因型频率差异无统计学意义;以是否合并高血压病对病例组人群进行分层后,cocaphase分析表明合并高血压的缺血性卒中组rs1800780位点的G等位基因频率较单纯缺血性卒中组明显增高（χ^2=5.508,df=1,P=0.019,OR=1.431,95%CI1.061~1.930）。卡方检验表明合并高血压病的缺血性卒中组GG基因型的频率较单纯缺血性卒中组明显增高（χ^2=6.322,P=0.042,df=2）。结论NOS3基因与缺血性卒中的发病无关,可能与高血压病的发生相关。

脑缺血性疾病的蛋白质组学研究进展

脑血管病是导致人类死亡的三大病因之一,而其中缺血性脑血管病约占75%~80%,其发病机制涉及多方面复杂因素;蛋白质组学作为新兴学科从整体角度,系统地研究动态变化的蛋白质组成分构成及其活动规律,为探索该病机制开辟了新途径。本文旨在综述蛋白质组学概念和主要研究技术,以及脑缺血个体体液、脑缺血个体脑组织、体外模拟缺血的细胞模型三方面的脑缺血性疾病蛋白质组学研究现状,为进一步开展该病蛋白质水平研究奠定基础。

颈交感干离断对局灶性脑缺血大鼠生存率影响的实验研究

目的研究颈交感干离断(transection of cervical sympathetic trunk,TCST)对局灶性脑缺血大鼠生存率的影响,为临床应用星状神经节阻滞疗法降低缺血性脑血管病死亡率提供实验依据。方法采用改良的ZeaLonga方法制备大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。雄性Wistar大鼠236只,随机分为:大脑中动脉栓塞模型组(M组)和颈交感干离断组(T组),颈交感干离断组在造成MCAO模型的同时行TC-ST。两组动物均按栓塞时间又分为6h、24h、48h、72h4个时间点,计算并比较M组与T组在上述各时间点生存率的区别。结果T组在24h、48h及72h平均生存率明显高于M组(P<0.05);T组与M组比较6h生存率无明显差别(P>0.05)。结论颈交感干离断能够有效的提高局灶性脑缺血大鼠的生存率并可能有治疗作用。