血红素加氧酶-1对食管癌Eca109细胞VEGF表达的影响

目的:研究血红素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)对食管癌Eca109细胞株血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法:利用氯化高铁血红素(Hemin)及体外设计合成的靶向抑制HO-1的小分子RNA(siRNA)分别诱导和沉默食管鳞癌Eca109细胞HO-1基因的表达,应用RT-PCR、Western blot检测HO-1 mRNA和蛋白表达水平。将实验分为Hemin(10μmol/L)处理组、HO-1siRNA+Hemin(10μmol/L)组、HO-1 siRNA组、空白对照组,分别以Western blot和ELASA法检测各组细胞VEGF的表达。结果:RT-PCR、Western blot检测结果显示Hemin(10μmol/L)可以有效诱导HO-1及VEGF的表达,而转染HO-1 siRNA可以成功抑制食管鳞癌Eca109细胞HO-1的表达;干扰Hemin诱导的HO-1后,VEGF的表达水平也随之降低。结论:HO-1 siRNA可有效沉默食管癌Eca109细胞HO-1的表达,并抑制HO-1诱导的VEGF的表达。

血红素加氧酶-1的表达对氟尿嘧啶诱导食管癌细胞凋亡的影响

目的本研究探讨血红素加氧酶-1与氟尿嘧啶诱导食管癌细胞凋亡的关系。方法培养ECa109食管鳞癌细胞,实验组分别加入正常培养基,含20μmol/L、80μmol/L锌原卟啉(Znpp IX)的培养基培养12h,后更换为含100μg/ml 5-FU组培养;对照组予正常培养基培养;共培养96h后检测各组细胞凋亡情况。结果在凋亡早期细胞中(Annexin V+/PI-),20μmol/L Znpp IX组(25.63%±6.52%)及80μmol/L Znpp IX(22.48%±5.59%)组显著高于5-FU组(12.89%±4.42%,P均<0.05)。在中晚期凋亡细胞(Annexin V+/PI+)中,20μmol/L Znpp IX组(25.17%±5.53%)显著低于5-FU组(39.89%±6.66%)及80μmol/L Znpp IX组(41.95%±2.92%,P均<0.01)。80μmol/L Znpp IX组caspase-3的活化率显著高于正常细胞(P<0.05)。结论 Znpp IX抑制HO-1表达后,可以显著增加5-FU诱导的Eca109食管癌细胞凋亡率,caspase-3参与了其诱导细胞凋亡的过程。

血红素加氧酶-1对食管癌细胞株Eca109增殖及凋亡作用的影响

目的研究血红素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)对食管癌细胞株Eca109增殖活性及凋亡作用的影响。方法利用体外设计合成的靶向抑制HO-1的低分子RNA(siRNA)沉默食管鳞癌Eca109细胞HO-1基因的表达,应用RT-PCR、Western blot检测HO-1 mRNA和蛋白表达水平,分别以MTS法、流式细胞术检测干扰HO-1后食管鳞癌Eca109细胞增殖和凋亡水平。结果 RT-PCR、Western blot检测结果显示转染HO-1 siRNA可以成功抑制食管鳞癌Eca109细胞HO-1的表达;与空白组、阴性对照组比较,HO-1 siRNA干扰组Eca109细胞增殖能力明显减弱,细胞凋亡率显著增加。结论 HO-1siRNA可有效沉默食管癌细胞HO-1的表达,抑制细胞的增殖活性,促进细胞的凋亡。

VEGF165基因重组腺相关病毒构建及转染猪骨髓间充质干细胞的研究

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的重组腺相关病毒载体,在体外转染猪骨髓间充质干细胞并观察其表达。方法细胞AAV包装质粒pAAV-IRES-ZsGreen及含hVEGF的质粒经EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切、连接,构建pAAV-hVEGF165-IRES-ZsGreen载体,采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获得rAAV2-hVEGF165及对照重组腺相关病毒,rea1-time PCR法测定病毒效价。Western blot检测重组rAAV2-hVEGF165在猪骨髓间充质干细胞的表达,MTS法检测VEGF蛋白活性。结果成功构建rAAV2-hVEGF165重组腺相关病毒载体,rAAV2-hVEGF165经双酶切和测序鉴定正确,rea1-time PCR法测定病毒效价为5×1012vg/ml。转染rAAV2-hVEGF165的猪骨髓干细胞能够有效表达VEGF蛋白,并能促进血管内皮细胞的增殖。结论成功构建rAAV2-hVEGF165重组腺相关病毒载体,并能在猪骨髓间充质干细胞中有效转染和表达,为进一步探索rAAV2-hVEGF165对治疗缺血性心肌疾病的研究提供实验基础。

RNA干扰HO-1的表达增强食管鳞癌Eca109细胞对氟尿嘧啶化疗的敏感度

目的探讨小干扰RNA沉默HO-1基因表达后食管鳞癌Eca109细胞对氟尿嘧啶化疗敏感度的影响。方法利用HO-1小干扰RNA(siRNA)及氯化高铁血红素分别沉默和诱导食管鳞癌Eca109细胞HO-1基因的表达,RT-PCR检测HO-1 mRNA水平,Western blot法检测HO-1蛋白表达水平,分别应用MTS法、流式细胞仪检测干预后Eca109细胞对氟尿嘧啶敏感度的变化。结果 RT-PCR、Western blot法检测结果显示,HO-1 siRNA能够有效抑制食管鳞癌Eca109细胞HO-1的表达。HO-1基因干扰后,氟尿嘧啶对Eca109细胞增殖抑制作用增强、凋亡细胞比例增加。结论干扰HO-1的表达可以显著增强食管鳞癌Eca109细胞对氟尿嘧啶化疗的敏感度。

重组人促红细胞生成素促进猪缺血心肌血管生成的实验研究

目的 观察重组人促红细胞生成素（rhEPO）对猪缺血心肌的血管生成效应及其作用机制.方法 选用12只6～8个月的巴马小型猪,应用胸腔镜微创技术将血管缩窄环放置于回旋支,利用心电图、冠状动脉造影评估回旋支闭塞或相应心肌缺血的程度,建立猪慢性心肌缺血模型.治疗组6只分别于建模后第1、3、7、14、21天皮下注射6 000 U rhEPO,对照组6只于同样的时间点皮下注射等量的生理盐水.用ELISA法检测治疗前及治疗后第3、7、14、21天血清中血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的分泌;28 d后行超声心动图检测左心室功能变化,行冠状动脉造影进行回旋支血流分级;取各组心肌,采用Western blot法检测VEGF、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化细胞外信号调节激酶（p-Erk）的表达,免疫组化染色法检测毛细血管和小动脉生成情况.结果 rhEPO治疗后第3天血清VEGF分泌水平达到高峰,至第28天时回落至接近基础水平;rhEPO治疗后,治疗组心功能较对照组改善明显;Western blot检测结果显示rhEPO治疗后1个月,VEGF、p-Akt和p-Erk蛋白表达水平都有不同水平的升高,其相对表达量分别是对照组的2.5倍、1.1倍和1.5倍（t=37.721、10.907、12.957,P均=0.000）.治疗组心肌毛细血管密度和小动脉密度分别为（944±98）％/mm2和（73±13） ％/mm2,对照组分别为（569±102） ％/mm2和（45±10）％/mm2,差异均有统计学意义（=4.214、2.869,P=0.016、0.023）.结论 rhEPO可促进猪缺血心肌血管的生成,其机制可能是通过上调p-Akt、p-Erk的表达实现的.

血红素加氧酶1基因启动子多态性与食管鳞状细胞癌的关系

目的 分析人血红素加氧酶1（HO-1）基因启动子区（GT）n微卫星多态性与汉族人群患食管鳞状细胞癌的风险及相关临床病理学特征的关联性,探讨（GT）n多态性与食管癌的关系.方法 选取2011年1月至2013年12月年龄为40～ 79岁的126例食管鳞状细胞癌患者为病例组,其中男性83例,女性43例,平均年龄（6l＆#177;8）岁;选择同期健康体检人群134名为对照组.对两组的血液标本应用PCR技术扩增（GT）n特定片段,并进行基因测序,根据（GT）n的重复次数把其分为S（n＜25）、M（25≤n＜30）、L（n≥30）3类等位基因,统计其频率分布情况,x2检验评价多态性与食管鳞状细胞癌及临床病理特征的关系.构建相应的启动子荧光素酶报告质粒,转染食管鳞状细胞癌细胞株Ecal09,检测相对荧光素酶活性比值,方差分析评价不同长度的（GT）n其启动子活性情况.结果 病例组L型等位基因频率（25.8％比14.9％,x2=9.520,P=0.002）、L型等位基因携带率高于对照组（41.3％比27.6％,x2=5.381,P=0.020）.L型等位基因携带患者较非L型等位基因携带患者有较高的淋巴结转移率（63.5％比41.8％,x2=5.685,P=0.017）和低分化鳞状细胞癌细胞检出率（53.8％比28.4％,x2=8.335,P=0.004）.H202处理组中,转染携带（GT）16重组报告质粒的Ecal09细胞株相对荧光素酶活性较双蒸水处理组增加（F=23.615,P=0.008）;在双蒸水处理组中,转染携带（GT）16重组报告质粒的细胞相对荧光素酶活性较（GT）26和（GT）36增加（F =41.376,P=0.003：F=50.761,P=0.002）.结论 携带HO-1基因启动子长（GT）n重复序列（n≥30）可能增加食管鳞状细胞癌的易感性并加大淋巴结转移的风险.