敲低SQLE基因对奶牛乳腺上皮细胞增殖及凋亡的影响

为了探讨角鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SQLE)基因对体外培养奶牛乳腺细胞凋亡及增殖的影响,本研究用RNAi技术敲低奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因;用实时荧光定量PCR方法检测奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因及凋亡和周期相关基因的表达;用CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;用周期和凋亡检测试剂盒筛选细胞,用流式细胞术准确计数处于不同周期的细胞数和凋亡细胞数。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞转染siRNA后,SQLE基因相对表达量显著下降(P<0.05),细胞增殖受到极显著抑制(P<0.01);G1期细胞数量显著下降(P<0.05),G2期细胞数量没有显著性改变,S期细胞数量显著上升(P<0.05);肿瘤坏死因子超家族成员6(又称Fas或CD5)的相对表达量显著上升(P<0.05),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(cyclin dependent kinase inhibitor 1B,P27)相对表达量显著上升(P<0.05),而细胞周期素D1(Cyclin D1)、B淋巴细胞瘤因子2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,P21)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X,apoptosis regulator,Bax)显著下降(P<0.05)。综上所述,敲低SQLE基因通过调节相关基因的表达抑制乳腺上皮细胞的增殖。

RNA干扰水牛MTPN基因对颗粒细胞增殖、凋亡及激素分泌的影响

本研究旨在探讨敲低MTPN基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖、凋亡及雌激素、孕酮分泌的影响。应用RNAi技术敲低颗粒细胞中MTPN基因的表达水平,通过实时荧光定量PCR方法检测体外培养水牛颗粒细胞中MTPN基因及增殖和周期相关基因的表达情况,CCK-8法检测细胞增殖,借助流式细胞仪检测细胞周期的分布,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中雌激素与孕酮含量。结果显示,经siRNA(si-MTPN)转染颗粒细胞后,MTPN基因相对表达量下降60%(P<0.01);细胞增殖受到显著抑制(P<0.05),G1期细胞数量下降,S期细胞数量上升,G2期细胞数量极显著上升(P<0.01),细胞被阻滞在G2期;增殖与周期相关基因Cyclin D2、Cytochrom C表达量显著上升(P<0.05),Caspase9、Fas基因表达量极显著上升(P<0.01);ELISA检测雌激素和孕酮分泌水平均显著下降(P<0.05)。综上表明,敲低MTPN基因能通过调控相关基因的表达抑制体外培养水牛颗粒细胞的增殖及雌激素、孕酮的分泌水平,为阐明MTPN基因参与家畜卵泡发生的分子机制提供参考。

奶牛早期妊娠诊断技术的研究进展

高效准确的早期妊娠诊断,可以缩短母牛的产犊间隔,从而达到提高母牛繁殖效率的目的。家畜早期妊娠诊断方法的研究具有悠久的历史,从原始的外部观察法到目前应用最广泛且最直接的直肠检查法,再到后期发展起来的超声波检查法以及近年来研究比较多的易于商业化的间接检测法。本文对在生产中具有实际应用效果且具有一定发展前景的早期妊娠诊断技术应用现状进行了综述。

生长抑素和皮质抑素双表达DNA疫苗免疫杂交水牛犊牛的促生长效果研究

试验旨在探究生长抑素(SS)和皮质抑素(CST)双表达DNA疫苗免疫杂交水牛犊牛的促生长效果及疫苗本身的安全性。将鉴定正确的pVGS/2SS-2A-S/CST-asd质粒电转入减毒猪霍乱沙门氏菌C500构建SS和CST双表达活载体疫苗,喷鼻免疫杂交水牛犊牛后观察其对犊牛生长性能的影响。选取体重相近的2~6月龄杂交水牛犊公牛24头,随机分为低(TL)、中(TM)、高(TH)剂量组和PBS对照组(NC),每组6头,初次免疫(简称初免)持续3 d,间隔2周后用相同剂量加免一次。结果显示,初免后2周便可产生抗SS和CST抗体,以TL组最佳,表现为更高的抗体水平和阳性率,7周时各试验组阳性率呈下降趋势;TL和TM组的平均日增重在初免后2和7周均高于对照组,但各组间差异均不显著(P>0.05),而抗体阳性组(P)的平均日增重在0~2周显著高于阴性组(N)(P<0.05)。相关激素的检测结果显示,在初免后2和7周,试验组生长激素(GH)和胰岛素生长因子1(IGF-1)的水平均高于对照组,且以TL组表现最佳,除初免后7周GH与对照组无显著差异外,其余均极显著高于对照组(P<0.01);初免后2周抗体阳性组极显著高于阴性组(P<0.05)。细胞因子检测结果显示,在初免后2周,试验组白细胞介素4(IL-4)含量高于对照组,且TL和TM组均极显著高于对照组(P<0.01),尤以TL组最高,免疫后7周TL和TH组均显著高于对照组(P<0.05),而免疫后2周对照组免疫干扰因子γ(INF-γ)含量极显著高于试验组(P<0.01),免疫后7周对照组INF-γ含量显著低于TL和TH组(P<0.05);阳性组IL-4水平在免疫后2周、INF-γ水平在免疫后7周均显著高于阴性组(P<0.05),其他各组间差异不显著(P>0.05)。对血清中血糖(GLU)、总蛋白(TP)、总胆固醇(CH)和尿素氮(BUN)水平进行测定发现,除免疫后2周总蛋白含量TL组显著高于对照组外(P<0.05),其他指标各组间差异均不显著(P>0.05)。对免疫后的水样、土样和粪样进行目的基因扩增发现,在PCR灵敏度范围内均未检测到,证实了疫苗的安全性。由上述结果可知,疫苗免疫后能取得良好的免疫效果,使机体产生显著的免疫应答,以低剂量组效果最佳,且没有对环境产生不良影响。

减毒猪霍乱沙门氏菌C500抗冻保护剂的优化研究

本试验旨在优化减毒猪霍乱沙门氏菌C500抗冻保护剂,提高工程菌C500的存活率。通过单因素试验考察了4种类型的抗冻保护剂(渗透性、半渗透性、非渗透性保护剂及抗氧化剂)对工程菌C500冷冻保存前后存活率的影响,各保护剂设置不同的浓度并与工程菌C500等体积混合,于液氮中保存2周后进行平板计数以计算其成活率,初步筛选出最有利于菌种保存的渗透性保护剂、半渗透性保护剂、非渗透性保护剂和抗氧化剂及其最佳保护浓度,最后将筛选出的4种保护剂进行四因素三水平的正交试验以得出最佳的组合配方。单因素试验的结果表明,渗透性保护剂中乙二醇、半渗透性保护剂中蔗糖、非渗透性保护剂中聚乙烯吡络烷酮(PVP)及抗氧化剂中甘氨酸对工程菌C500的保护作用最佳,最佳保存浓度分别为15%、6%、6%和0.25%;正交试验结果表明,各因素均对工程菌C500的存活率有显著影响,筛选出的最佳组合配方为17%乙二醇、9.0%蔗糖、6.0%PVP、0.35%甘氨酸,最佳组合在-80℃的保存效果最佳,此温度下保存6周存活率可达88.34%,其次为液氮组、-20℃组及4℃组。这表明本试验得到的保护剂配方极大地提高了工程菌C500的抗冻能力,使其存活率大大提高。

KIH结构在人白介素-35体外重组表达中的应用

白细胞介素35(interleukin-35,IL-35)是非常重要的免疫抑制性细胞因子,被证实在多种疾病的免疫应答中发挥作用。本研究通过克隆人IL-35基因编码序列,构建单亚基表达载体pXC17.4-p35和pcDNA3.1(+)-EBI3,共转染CHO-K1细胞体外表达IL-35,经检测未发现p35亚基与EBI3亚基的结合。Knobs-into-Holes(KIH)可解决异源抗体重链错配的问题,因此,在原始序列的基础上融合KIH结构构建表达载体pXC17.4-p35-Fch和pcDNA3.1(+)-EBI3-Fck来表达KIH-IL-35重组融合蛋白质;同时交换2个亚基的表达载体来验证不同表达载体对KIH-IL-35表达量的影响。经过多种蛋白质检测方法的分析,显示KIH-IL-35结构的正确表达率明显提高。大量表达后对KIH-IL-35进行亲和纯化,采用ELISA法检测纯化后的KIH-IL-35与糖蛋白130(gp130)分子的结合活性,结果表明,KIH-IL-35与gp130的结合呈浓度依赖性。采用细胞活性检测方法检测KIH-IL-35与M1细胞的间接活性,结果表明,M1细胞的抑制率与KIH-IL-35的浓度呈剂量依赖性增长。此外,本研究成功建立了一种利用激活的人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)对IL-35进行活性检测的方法,结果显示,激活的PBMCs与KIH-IL-35的浓度呈剂量依赖性增长。总之,本研究利用KIH-IL-35模型,提高了重组人IL-35的正确表达率,并验证其在体外的高活性,为IL-35的研究及类似异源二聚体细胞因子的重组表达提供新思路。