聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子高表达对糖基化终末产物诱导下视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

目的观察聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子(PSF)高表达对糖基化终末产物(AGEs)诱导下RPE细胞损伤的保护作用。方法将体外培养的人RPE细胞分为正常对照组(N组)、空白对照组(N+AGAGEs组)、空载体对照组(Vec+AGEs组)、PSF高表达组(PSF+AGEs组)。N组RPE细胞常规培养;N+AGEs组只做转染处理但不导入任何外源性基因的RPE细胞联合AGEs诱导;Vec+AGEs组、PSF+AGEs组利用转染试剂脂质体2000将pcDNA空载体或pcDNA-PSF真核表达质粒导入RPE细胞联合AGEs诱导。除N组以外,其余3组细胞进行相应的转染处理,24 h后应用150μg/ml的AGEs刺激72 h。采用HE染色和Hoechst 33258染色观察PSF高表达对RPE细胞凋亡相关形态改变的影响;通过ROS水平检测分析PSF高表达对AGEs诱导的RPE细胞ROS表达的影响;采用MTT比色法检测PSF高表达对RPE细胞生存力的影响;采用Western blot检测PSF不同作用时间及不同剂量对血红素氧合酶1(HO-1)表达的影响。结果HE染色和Hoechst 33258染色观察发现,N组细胞形态饱满,细胞核呈圆形,细胞质丰富,染色均一;N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞体积缩小,嗜酸性染色增强,细胞核致密浓染、固缩甚至碎裂;PSF+AGEs组细胞形态尚饱满,细胞浆染色较均匀,细胞核染色均一。MTT比色法检测结果显示,PSF高表达可有效提高RPE细胞生存力,但该作用可被ZnPP有效拮抗,且差异有统计学意义(F=33.26,P<0.05)。DCFH-DA法检测结果显示,与N+AGEs组、Vec+AGEs组比较,PSF+AGEs组细胞中ROS产量下降,差异有统计学意义(F=11.94,P<0.05)。Western blot检测结果显示,PSF蛋白以时间、剂量依赖性的方式上调HO-1的表达水平。PSF蛋白作用24、48、72 h的HO-1相对表达水平较0 h明显升高,差异有统计学意义(F=164.91,P<0.05)。0.1、0.5、1.0、1.5、2.0μg PSF蛋白作用下的HO-1相对表达水平较0.0μg明显升高,差异有统计学意义(F=104.82,P<0.05)。结论PSF可能通过上调HO-1的表达而抑制ROS产生,从而对AGEs诱导下的RPE细胞损伤发挥保护作用。

慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的抑制作用

目的观察慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子(PSF)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法5日龄C57BL/6J小鼠112只随机分为正常对照组、单纯OIR模型组、OIR模型+慢病毒空载体处理组(以下简称Vec组)及OIR模型+PSF慢病毒处理组(以下简称PSF组),分别为16、32、32、32只。小鼠7日龄时,正常对照组小鼠常规环境饲养;单纯OIR模型组、Vec组及PSF组小鼠建立OIR模型。小鼠12日龄时,Vec组、PSF组小鼠玻璃体腔分别注射滴度为1×1011 TU/ml的空载体病毒或PSF慢病毒1μl。正常对照组和单纯OIR模型组小鼠不再做任何处理。小鼠17日龄时,采用HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核;作视网膜铺片,测量各组小鼠视网膜无灌注区相对面积;采用实时定量PCR检测各组小鼠视网膜中NF-E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶1(HO-1)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测各组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1及PSF的蛋白相对表达量。组间比较采用单因素方差分析。结果正常对照组、单纯OIR模型组、Vec组、PSF组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09个;视网膜无灌注区面积分别为0.00%、(35.71±2.81)%、(36.57±4.53)%、(15.33±4.75)%。4组间小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数及视网膜无灌注区面积比较,差异均有统计学意义(F=24.87、165.70,P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组较正常对照组突破内界膜的血管内皮细胞核数增多,视网膜无灌注区面积增大;PSF组较单纯OIR模型组、Vec组突破内界膜的血管内皮细胞核数减少,视网膜无灌注区面积减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。实时定量PCR及Western blot检测结果显示,4组间小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量(F=53.66、83.54)以及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量(F=58.38、52.69、24.79)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较正常对照组明显降低,PSF组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较单纯OIR模型组、Vec组明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的PSF可通过上调Nrf2及HO-1的表达抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成。

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对缺氧诱导人视网膜微血管内皮细胞功能的影响

目的观察多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)功能的影响。方法采用三质粒系统构建慢病毒颗粒(LV)-PSF。LV-PSF体外感染hRMECs后通过流式细胞计数法测定其感染效率。应用实时定量PCR(RT-PCR)检测经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA表达水平。将实验分为体内和体外两部分。体内实验:7日龄健康C57B/L6小鼠20只,采用随机数字表法分为正常组、氧诱导视网膜病变(OIR)组、OIR+LV-空载体(Vec)组和OIR+LV-PSF组,每组5只。除正常组外,其余3组构建OIR模型。OIR组除缺氧刺激外,不做其余处理。OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠分别玻璃体腔注射LV-Vec或LV-PSF。观察LV-PSF对视网膜新生血管(RNV)形成的影响。体外实验:将hRMECs分为正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组。正常组为正常体外培养的hRMECs;缺氧组为缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs;空载组、PSF高表达组分别为用LV-Vec、LV-PSF感染48 h,再用缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs。采用MTT比色法观察PSF对细胞增生能力的影响。采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验观察PSF对缺氧刺激下细胞迁移能力的影响。采用RT-PCR观察各组细胞中HIF-1α、VEGF及PSF的mRNA表达。结果成功构建可稳定高表达PSF的LV-PSF,流式细胞仪测定其感染效率为97%,RT-PCR测得经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA水平明显上调。体内实验:OIR组、OIR+LV-Vec组小鼠RNV面积较正常组明显增加(t=18.31、43.71),OIR+LV-PSF组小鼠RNV面积较OIR组(t=11.30)、OIR+LV-Vec组(t=15.47)明显减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。体外实验:MTT比色法检测结果显示,缺氧组hRMECs增生能力较正常组明显增强(t=2.57),PSF高表达组hRMECs增生能力较正常组、缺氧组、空载组明显降低(t=5.26、5.46、3.73),差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,缺氧刺激3 h恢复正常条件24 h或48 h均可刺激缺氧组与空载组细胞明显迁移(t=8.35、13.84,P<0.05);而与缺氧组与空载组比较,PSF高表达组细胞迁移不明显(t=10.99、18.27、9.75、8.93、26.94、7.01,P<0.05)。Transwell小室实验结果显示,正常组和空载组微孔膜上染色的细胞数较多,而PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数明显减少(t=9.33、6.15,P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,与正常组比较,缺氧组、空载组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显增加(t=15.23、21.09,P<0.05),PSF mRNA表达无明显变化(t=0.12、2.15,P<0.05);与缺氧组、空载组比较,PSF高表达组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显下降(t=10.18、13.10,P<0.05),PSF mRNA表达明显增加(t=65.00、85.79,P<0.05)。结论PSF可减少OIR模型小鼠RNV面积。PSF可能通过HIF-1α/VEGF信号通路抑制缺氧诱导的hRMECs增生和迁移。