人核蛋白P68 cDNA基因克隆及全序列测定

靠人工合成4个混合寡聚核苷酸探针,从一个人胎盘λgt11 cDNA库中筛选到含有p68 cDNA基因的阳性噬菌斑。经次克隆得到含p68 cDNA基因的pBRB_(T7)—p68质粒。用末端终止法对此cDNA基因进行了全序列测定。分析结果证明得到的p68 cDNA基因含有2287个核苷酸,具有一个可阅读框架,共编码614个氨基酸。其5′端非编码区含有130个碱基。3′端非编码区含有315个碱基,比已发表的3′端非编码区多23个碱基。

定点突变及非定点突变技术的新进展

1992年是Zoller和Smith的寡核苷酸诱导的定点突变方法发表十周年[1]。这方法发表后的前几年中,以此方法为基础,改进了的定点突变方法,如雨后春笋相继产生,如Kunkel等人(1985),Calter等人(1985)及Tayler和Eck-stein等人(1985)的改进方法。这些改进方法使突变效率得到了很大的提高[2]。可以说定点突变技术在蛋白质工程研究中发挥了很大的作用。随后非定点突变技术也有了新的改进,如错误参入法,饱和突变技术等在用来寻找具有新的活性蛋白质序列中发挥了作用[3]。现综述一下近几年来定点突变及非定点突变技术的发展情况。

真核细胞中基因的转录调控

叙述了真核细胞三种ＲＮＡ聚合酶合成的基因的转录调控。由于真核细胞ＤＮＡ含量非常大，其基因的转录调控具有以下特点：参与的转录因子多；与顺式ＤＮＡ序列元件结合呈一定顺序。这反映了真核细胞中基因的转录调控是由多个转录因子间的相互作用来实现的．

人尿激酶原全长cDNA基因的分离与鉴定

将两对人工合成的寡聚核苷酸,经体外延伸后制备成探针。用此探针,从一种以λ_gt11为载体的人胎盘cDNA库中,经3次纯化杂交筛选,分离出21个阳性克隆。对其中4个阳性克隆子进行了限制性内切酶图谱、Southern印迹法及部分序列分析鉴定。证明了四个克隆子中的3个,除具有完整的人尿激酶原cDNA编码区外,还具有包含起始密码子在内的20个氨基酸信号肽部分及5′端、3′端非编码区。这些阳性克隆子可用于人尿激酶原的基因工程研究。

心脏型脂肪酸结合蛋白诊断急性心肌梗死早期指标的可行性研究

目的 测定急性心肌梗死 (AMI)患者、冠心病患者及正常人血清中心脏型脂肪酸结合蛋白 (h- FABP)的水平 ,以检测其作为 AMI早期诊断指标的有效性 ,为早期诊断 AMI提供特异而敏感的生化指标。方法 (1 )从心脏组织中利用 RT- PCR方法克隆 h- FABP基因 ,并转入 E.coli中表达 ;(2 )制备抗 h- FABP的单抗和多抗 ;(3)利用 ELISA方法 ,测定不同血清中 h- FABP的浓度。结果 (1 ) h- FABP在 E.coli中高水平表达 ,并经纯化得到了人的 h- FABP;(2 )制备了抗 h- FABP的单抗及多抗 ,并通过纯化得到了特异于 h- FABP的 Ig G;(3) AMI患者血清中的 h- FABP浓度明显高于冠心病患者和正常人 ,并且在发病后 2 h开始升高 ,在 5～ 6 h内达到最高值 ,在 1 2～ 2 4 h内恢复到正常水平。结论 h- FABP对于早期诊断 AMI具有较高的敏感性和特异性 ,是早期诊断

蛋白质工程的研究

对近期蛋白质工程的工作进行了综合报道，涉及到胰蛋白酶、金属硫蛋白、胰岛素、尿激酶原、组织型纤溶酶原激活剂、ＲＧＤ肽等蛋白质或多肽的结构与功能研究以及分子改造。

影响大肠杆菌中外源基因表达的因素

大肠杆菌已经被广泛地应用于表达各种外源基因，但是，不同的外源基因在表达效率上却有很大的差异，文章综述了影响大肠杆菌中外源基因表达的因素，这将有助于认识大肠杆菌中外源基因表达的规律，以便采取有效的方法提高外源基因在大肠杆菌中的表达效率．

树突状细胞肿瘤疫苗的研究进展

在抗肿瘤免疫应答中 ,关键的一步是抗原呈递细胞将肿瘤抗原呈递给 T淋巴细胞。树突状细胞是专职抗原呈递细胞 ,它能够有效的将肿瘤抗原呈递给 T细胞 ,引发机体产生抗肿瘤的免疫应答。因此 ,利用树突状细胞制备肿瘤疫苗可望提供一种有效的肿瘤免疫治疗方法。目前 ,体外实验、动物实验和初期的临床实验都已经证明了树突状细胞肿瘤疫苗的抗肿瘤作用。本文主要介绍树突状细胞的生物学特征和树突状细胞肿瘤疫苗在肿瘤免疫治疗中的研究进展。

大肠杆菌中包含体的形成及其活性表达产物的分离

随着基因工程研究的发展,人们可以利用动物、植物细胞或微生物来合成动物体内某些含量较低、但又有很大药用价值的蛋白分子,如生长激素,白细胞介素-2、尿激酶等等。 在利用微生物进行基因工程的生产中,大肠杆菌(E.coli)是人们常用来做表达目的基因的宿主菌。由这一途径来生产这些天然含量较低的物质,具有产量高,成本低,

小C肽人胰岛素原类似物(B-Arg-Arg-A)和人胰岛素原(B-C-A)A、B链重组条件的研究

目的 :获得更佳的变复性条件和提高人胰岛素原的重组率。方法 :采用特有的重组方法 ,将小C肽人胰岛素原类似物 (B Arg Arg A)与人胰岛素原 (B C A)进行重组条件的比较。 结果 :发现二者在 pH10 .6左右处重组率达到最大 ,且在相同的条件下B Arg Arg A蛋白质的重组率 (94% )较B C A蛋白质 (82 % )的高。结论 :进一步验证了“胰岛素的A、B链含有足够使二硫键正确配对的结构信息”的论点。

去B链羧端三肽人胰岛素的分离纯化及其性质研究

将去Ｂ链羧端三肽人胰岛素原基因克隆到表达质粒ｐＢＶ２２０上，在大肠杆菌系统中经温度诱导表达，表达产物占细胞总蛋白量的１２％，表达产物经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析分离以及胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ的酶促转化等步骤，可得到去Ｂ链羧端三肽人胰岛素，其纯度达９３％，其氨基酸组成与预期值相符，但其受体结合活性仅是标准猪胰岛素的４５％．

重组PAI-1在大肠杆菌中的高效表达

纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)在天然状态下含量很低。为了进行PAI-1的结构与功能的研究,构建了表达重组PAI-1的质粒pBV220/PAI-1,并在大肠杆菌中得到了高效表达。最高表达量为菌体总蛋白量的49％以上。经Western blotting检测,得到了分子量为43.0kDa的反应条带。对形成包涵体的表达产物进行变、复性处理及Sephadex G-75的初步纯化,得到了潜伏态的重组PAI-1。用纤维蛋白平板法和显色底物法,测定出经4mol/L盐酸胍激活后的重组PAI-1对尿型纤溶酶原激活物(u-PA)有明显的抑制活性。而且,激活后的重组PAI-1经过37℃处理,会逐渐转变为潜伏态。

人16型乳头瘤病毒“假病毒”免疫保护作用的研究

目的评价构建的人16型乳头瘤病毒“假病毒”的免疫保护作用。方法利用杆状病毒表达系统在sf9昆虫细胞中表达组装了人16型乳头瘤病毒病毒样颗粒,将病毒样颗粒解聚后与真核表达质粒混合,重聚集成“假病毒”。用这种“假病毒”对小鼠进行免疫保护作用研究。结果小鼠经“假病毒”免疫后,可以在血清中检测到特异性的IgG,在阴道分泌物中检测到特异性的IgA,脾淋巴细胞可以检测特异性的CTL活性。结论“假病毒”

从基因工程小C肽人胰岛素原类似物（B－R2－A）制备人胰岛素

以融合蛋白的形式，在Ｅ．ｃｏｌｉ中经温度诱导表达了小Ｃ肽人胰岛素原类似物（Ｂ－Ｒ２－Ａ）．表达的融合蛋白可占细胞总蛋白６８％．经磺酸解，及初步分离Ｓ－磺酸型融合蛋白，再经ＣＮＢｒ裂解后，进行还原重组，ＨＰＬＣ分离纯化等步骤，每升发酵液可得到Ｂ－Ｒ２－Ａ约５０ｍｇ。经酶促转化及ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５纯化，得重组人胰岛素约２０ｍｇ，其氨基酸组成与人胰岛素相同，并具有与猪胰岛素相同的生物活性．

P68──一种广泛存在于真核细胞中的核蛋白

本文对近年来在真核细胞中发现的Ｐ６８核蛋白研究历史、分布情况、生物学功能以及其基因在人染色体上的定位等方面进行了系统的评述。同时还对该蛋白在结构特征与功能特性及与某些重要功能蛋白间的相关关系进行了讨论。

重组抗人活化血小板单链抗体-尿激酶原导向溶栓剂的基因构建及表达

为了获得特异性高的导向溶栓药物,应用PCR技术,得到抗人活化血小板单抗(SZ-51)的Fab′基因片段。再用酶切方法,将Fab′中CH1基因片段替换成合成的连接分子(linker)基因,构建成单链抗体基因,并插入到人尿激酶原分泌肽基因及低分子量单链尿激酶(scu-PA-32k)之间,最终构建成重组抗人活化血小板单链抗体-尿激酶原融合蛋白基因。此融合蛋白基因在昆虫细胞中得到表达。纯化的表达产物SDS-PAGE鉴定,其分子量约为60kD,与预期值相符。其比活为9000IU/mg蛋白。ELISA法初步证明此重组的融合蛋白具有与活化血小板抗原结合特异性。

去B链羧端七肽人胰岛素的分离纯化及性质研究

在大肠杆菌温度诱导体系中以非融合方式进行去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原基因的表达，获得去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原，表达产物占细胞总蛋白量的１３％，表达产物经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析分离及胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ的酶促转化等步骤，可得到纯度达９４％以上的去Ｂ链羧端七肽人胰岛素，其氨基酸组成与预期值相符，受体活性是标准猪胰岛素的１％．

人16型乳头瘤病毒“假病毒”的制备

利用杆状病毒表达体系,在sf9细胞中表达人16型乳头瘤病毒(Human Papillomavirus type16,HPV16)的晚期表达蛋白L1,通过超速离心的方法得到HPV16病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)。VLPs经过DTT和EDTA处理解聚成L1蛋白,将构建好的真核表达载体E6E7-pcDNA3.1+与解聚的L1蛋白混合,透析除去DTT和EDTA并逐渐升高Ca2+的浓度,解聚的L1能够重新聚集成VLPs,其中一部分VLPs包裹了真核表达载体,和天然的人乳头瘤病毒的构成很相似,作者称之为“假病毒”。

人乳头瘤病毒多肽与人免疫球蛋白G融合表达

目的 将人乳头瘤病毒 16型 (Humanpapillomavirustype 16 ,HPV 16 )的晚期表达蛋白E7上的抗原 2 4肽 (从第38位氨基酸到第 6 1位氨基酸 )与人免疫球蛋白G的重链恒定区融合表达 ,并以此融合蛋白作为抗原 ,可能为HPV 16病毒感染防治提供免疫治疗方法。方法 利用PCR方法分别扩增HPV 16E7(38- 6 1) 2 4肽的DNA片段和人免疫球蛋白G的重链恒定区DNA片段 ,并构建到pET2 1a表达载体上 ,转化入E .coli中表达 ,利用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和蛋白质免疫印迹 (Western blotting)的方法对表达结果进行鉴定。结果 构建的表达载体HPV16E7e hIgGHCCR pET2 1a经酶切鉴定和测序显示序列正确 ;通过SDS PAGE和Western blotting的鉴定 ,重组融合蛋白Mr 约 4 0 0 0 0 ,表达量可占菌体蛋白的 2 0 %左右。结论 成功构建HPV16 E7的抗原多肽片段和人免疫球蛋白G的重链恒定区的融合蛋白 ,并可在E .coli中高效表达。

利用噬菌体T＿7RNA聚合酶在大肠杆菌（E．coli）中引导人尿激酶原克隆基因的表达

我们将人尿激酶原基因（ｐｒｏ－ＵＫ）重组到含Ｔ＿７基因１０启动子的质粒（ｐＥＴ３ｃ）中，用异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）的ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中进行表达。经纤维蛋白平板测活法测得表达产物存在于包含体中。经变性和复性处理后，表达量达每升培养液１６００ＩＵ．用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法鉴定表达产物为单一条带。分子量在４３ｋＤａ左右，略低于天然５４ｋＤａｐｒｏ－ＵＫ。这可能与Ｅ．ｃｏｌｉ中缺乏糖基化酶有关。