基于理性设计提高1,3-丙二醇氧化还原酶的稳定性和活性

1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol oxidoreductase,PDOR)是甘油生物合成1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)的关键限速酶之一。使用PoPMuSiC 2.1计算肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)来源PDOR(KpPDOR)突变的折叠自由能,结合HotSpot Wizard 3.0对催化中心附近氨基酸的功能热点分析和保守残基鉴定,理性选取突变位点,构建定点突变。经诱导表达、蛋白纯化和酶学性质研究,获得催化性能、热稳定性和pH耐受性提高的突变体。V155N突变体在37℃,pH 7.5下的还原活性为KpPDOR的1.7倍,pH 4.0时是KpPDOR的2.5倍。N262E突变体37℃下半衰期为KpPDOR的1.4倍。分析蛋白结构,发现Val155突变为Asn导致新形成两个氢键,稳定了Val155所在的β-折叠结构。而Asn262突变为Glu形所成的两个氢键,可增强催化中心刚性,提升酶稳定性。静息细胞转化甘油合成1,3-PD,发现突变体V155N工程菌株1,3-PD产能为1.16 mmol/L/OD_(600),高于野生型KpPDOR工程菌株的0.82 mmol/L/OD_(600)。此理性设计方法对改良其他工业酶的性能有一定参考价值。

构建可合成非天然辅酶的圆红冬孢酵母工程菌

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)及其还原态是生物体通用的氧化还原辅酶和重要小分子,参与胞内众多代谢反应,因此调控NAD水平不仅难以选择性作用于代谢途径,还常常产生意外的生物学效应。最近研究发现利用非天然辅酶烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(nicotinamide cytosine dinucleotide,NCD),可构建正交的氧化还原催化体系,为调控胞内代谢提供了新机遇。为实现在产油酵母圆红冬孢酵母中建立NCD介导的氧化还原代谢,采用农杆菌介导转化方法,在基因组整合表达密码子优化的NCD合酶(NcdS)编码基因NCDS,获得系列有效表达NcdS的工程菌株。酶偶联法分析发现,工程菌细胞裂解液NcdS酶活达8.1×10;U/OD;。通过高效液相色谱法(HPLC)和超高分辨率质谱检测,确定细胞裂解液可催化合成NCD。在培养基内补加5.0 mmol/L烟酰胺核糖后,工程菌胞内合成NCD达41.6μmol/L。对工程菌进行发酵和油脂提取,发现胞内表达NCD合酶未导致细胞产油性能降低,后续可通过表达其他NCD偏好性酶,有望在圆红冬孢酵母中建立受NCD调控的油脂合成代谢体系。