大熊猫白血病抑制因子RNAi干扰载体的构建及应用

旨在构建大熊猫白血病抑制因子(LIF)RNAi重组质粒,以期进一步研究LIF对大熊猫骨髓间充质干细胞(PDBM-MSCs)的调控作用.试验设计3组大熊猫LIF shRNA慢病毒pLKO.1 puro-LIF-down干扰载体,通过慢病毒的方式感染PDBM-MSCs,经q-PCR鉴定重组质粒pLKO.1 puro-LIF-down-1抑制效果最显著.pLKO.1 puro-LIF-down-1实验组和空质粒对照组比较发现,LIF mRNA表达水平抑制后能够显著下调细胞周期调控基因CDK2、CCNB2、CCND3的mRNA表达水平(P<0.05);显著上调凋亡基因P53、P16、P27、caspase3的mRNA表达水平(P<0.05);显著下调干性基因KLF4、SOX2的mRNA表达水平(P<0.05).以上结果表明,此次研究成功构建出大熊猫LIF RNAi干扰载体,LIF对PDBM-MSCs的生长和干性维持具有重要的调控作用,为大熊猫干细胞的体外培养及干性机制的研究奠定基础.

大熊猫LIF基因的原核表达及其单克隆抗体的制备与鉴定

为获得大熊猫LIF单克隆抗体,将大熊猫LIF基因编码区23~203基因片段添加酶切位点合成后连接到pET30a原核表达载体上,转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达、纯化蛋白后作为免疫原,对BALB/c小鼠进行免疫,并按照常规方法制备杂交瘤细胞,应用间接ELISA方法筛选鉴定阳性杂交瘤细胞株。结果显示,成功构建了LIF(23-202)-pET30a重组质粒,获得了高纯度的LIF重组蛋白免疫原,得到1株能分泌大熊猫LIF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体亚型为IgG2b。Western-blot结果显示,LIF-2单克隆抗体可特异性识别大熊猫子宫内膜间质细胞、睾丸支持细胞、皮肤细胞、脐带间充质干细胞及骨髓间充质干细胞中的LIF蛋白。上述结果为阐明LIF的定位和组织表达信息,探讨LIF在大熊猫胚胎着床中的作用奠定了重要基础。

雄性大熊猫褪黑素与睾酮季节性变化

褪黑素通过调控下丘脑-垂体-性腺内分泌轴使季节性繁殖动物在适宜的季节进行繁殖活动。大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)在春季集中繁殖。为探究雄性大熊猫褪黑素和睾酮的季节性变化规律,本研究选取成都大熊猫繁育研究基地3只成年雄性大熊猫作为实验对象,在自然光照下对这3只大熊猫进行每周1次为期1年(2018年8月至2019年7月)的尿液样品采集。依据当地气候情况,将3至5月作为春季,6和7月为夏季,8至11月为秋季,12月至翌年2月为冬季。采用酶联免疫法(ELISA)测定尿样中褪黑素和睾酮水平。采用单因素方差分析(one way-ANOVA)及独立样本T检验对四个季节激素水平进行差异性分析。结果表明,褪黑素水平在冬季分别极显著高于秋季、春季及夏季(P<0.01),秋季、春季以及夏季三个季节间差异不显著(P>0.05)。睾酮水平在冬季分别极显著高于秋季与夏季(P<0.01),春季亦分别极显著高于秋季与夏季(P<0.01),但冬季与春季差异不显著(P>0.05),秋季与夏季亦差异不显著(P>0.05)。研究表明,雄性大熊猫褪黑素和睾酮分泌水平呈现出季节性变化,从秋季到冬季,雄性大熊猫褪黑素和睾酮水平同步升高,从冬季到春季繁殖季节,褪黑素水平极显著下降,但睾酮仍处在高位水平。该研究结果可为进一.步研究褪黑素对大熊猫季节性繁殖影响提供基础数据。