来氟米特干预肾小球系膜细胞Smad2的表达及Ⅳ型胶原分泌的体外研究

目的观察来氟米特(leflunomide,LEF)在转化生长因子β1(TGF-β1)刺激大鼠肾小球系膜细胞(GMC)表达Smad2及Ⅳ型胶原(ColⅣ)过程中发挥的作用。方法建立体外培养大鼠肾小球系膜细胞模型,经鉴定后第7代用于实验。按照对大鼠肾小球系膜细胞模型处理方式不同,实验分4组,对照组(只加培养液),TGF-β1组(TGF-β1 5 ng/ml),LEF-1组(LEF 5 ng/ml+TGF-β1 5 ng/ml)和LEF-2组(LEF 50 ng/ml+TGF-β1 5 ng/ml)。分别于15min、30min、1h、2h和6h收集标本,用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测定细胞培养上清液的ColⅣ胶原蛋白表达量的变化。用间接免疫荧光法检测各组磷酸化Smad2(P-Smad2)蛋白表达的变化;采用荧光半定量RT-PCR法检测各组Smad2 mRNA表达的变化。结果在各时间点,TGF-β1刺激组ColⅣ分泌量高于对照组(P<0.05),LEF各组Ⅳ胶原分泌低于TGF-β1(P<0.05)。对照组P-Smad2蛋白有少量的表达;TGF-β1组表达升高,有统计学意义(P<0.05),与TGF-β1组相比,两LEF组P-Smad2表达下降,有统计学意义(P<0.05)。肾小球系膜细胞中,TGF-β1组Smad2 mRNA表达高于对照组。LEF-1组和LEF-2组Smad2 mRNA表达水平低于TGF-β1组(P<0.01)。但两LEF组间比较无统计学意义(P>0.05)。LEF干预作用有时间性,随时间延长,其LEF干预作用逐渐减弱。结论经TGF-β1刺激后,体外培养的大鼠肾小球系膜细胞磷酸化-Smad2表达及Ⅳ胶原分泌增加,来氟米特可降低Smad2表达和Ⅳ胶原分泌水平,减轻细胞外基质(ECM)的沉积,为来氟米特的肾脏保护作用提供实验依据。

转化生长因子-β1诱导下肾小球系膜细胞Smad2的表达与Ⅳ型胶原分泌的相关性研究及来氟米特的干预作用

目的探讨转化生长因子(TGF)-β1诱导肾小球系膜细胞(GMC)中Smad2的表达与Ⅳ型胶原(ColⅣ)表达的相关性及来氟米特(LEF)的干预作用。方法建立体外培养大鼠GMC模型,经鉴定后第7代用于实验。按照对大鼠GMC模型处理方式将其分为:TGF-β1组(培养液+TGF-β1 5ng/mL),LEF-1组(培养液+LEF 5μg/mL+TGF-β1 5ng/mL),LEF-2组(培养液+LEF 50μg/mL+TGF-β1 5ng/mL)与对照组(仅加入培养液)。分别于15min,30min,1h,2h和6h收集标本,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定细胞培养上清液ColⅣ表达。采用间接免疫荧光法检测各组磷酸化(P)-Smad2蛋白表达;采用荧光半定量RT-PCR法检测各组Smad2mRNA表达。结果在各时点,①ColⅣ表达量比较:TGF-β1组显著高于对照组(P<0.05),LEF-1与LEF-2组均显著低于TGF-β1组(P<0.05)。②P-Smad2表达量比较:在对照组仅少量表达,TGF-β1组表达明显升高,与对照组比较,差异有显著意义(P<0.05);LEF-1与LEF-2组的P-Smad2表达较TGF-β1组显著下降,差异有显著意义(P<0.05)。③Smad2mRNA表达量比较:在TGF-β1组表达显著高于对照组(P<0.05),而在LEF-1组与LEF-2组显著低于TGF-β1组(P<0.01);但LEF-1组与LEF-2组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。④GMC上清液中,ColⅣ与Smad2mRNA表达量呈正相关(r=0.707,P<0.05)。结论经TGF-β1刺激后,体外培养大鼠GMC中P-Smad2表达及ColⅣ表达量均增加,因此LEF可降低Smad2表达与ColⅣ表达水平,减轻细胞外基质(ECM)沉积。本研究结果为LEF的肾保护作用提供了实验依据。

来氟米特对转化生长因子β_1诱导的体培养的大鼠肾小球系膜细胞中Smad2表达的影响

目的观察来氟米特(leflunomide,LEF)在转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β_1刺激大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)表达Smad2过程中发挥的作用。方法建立体外培养大鼠肾小球系膜细胞模型,经鉴定造模成功后第7代用于实验。按照对模型大鼠体外培养的肾小球系膜细胞的处理方式不同,将其分为TGF-β_1组(TGF-β_1 5 ng/mL),LEF-1组(LEF 5μg/mL+TGF-β_1 5 ng/mL),LEF-2组(LEF 50μg/mL+TGF-β_1 5 ng/mL)和对照组(无血清RPMI 1640培养液+20%胎牛血清)。分别于15 min,30 min,1 h,2 h和6 h收集标本,用间接免疫荧光法检测各组磷酸化Smad2(phosphorylation-Smad2,p-Smad2)蛋白表达变化;采用荧光半定量RT-PCR法检测各组Smad2mRNA表达变化。结果对照组磷酸化Smad2蛋白少量表达,阳性细胞率为(21.40±1.51)%。TGF-β_1组阳性细胞率为(70.00±3.23)%,30 min时表达开始升高,1 h及2 h时表达明显增高,6 h表达开始下降。各时间点LEF-1组和LEF-2组磷酸化Smad2蛋白表达下降,阳性细胞率分别为(23.60±2.80)%和(25.81±1.29)%,细胞荧光强度呈减弱趋势。与TGF-β_1组相比,LEF-1组和LEF-2组磷酸化Smad2蛋白表达下降,差异有显著意义(P<0.05)。但LEF-1组和LEF-2组与对照组比较,差异无显著意义(P>0.05)。肾小球系膜细胞中Smad2mRNA相对表达量,TGF-β_1组显著高于对照组,2 h时达高峰。LEF-1组和LEF-2组Smad2mRNA显著低于TGF-β_1组,差异有显著意义(P<0.01);但LEF-1组和LEF-2组间比较,差异无显著意义(P>0.05)。LEF-1组和LEF-2组Smad2mRNA相对表达量1h时较低,之后逐渐升高,说明随时间延长,来氟米特对体外培养的肾小球系膜细胞干预作用逐渐减弱。结论经转化生长因子-β_1刺激后,体外培养的大鼠肾小球系膜细胞磷酸化Smad2蛋白和Smad2mRNA相对表达量分别增加,来氟米特可降低Smad2蛋白和Smad2mRNA表达水平,为来氟米特的肾脏保护作用提供理论依据。