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胱天蛋白酶募集域蛋白9?麦芽糖结合蛋白融合蛋白的原核表达及纯化
被引量:
3
1
作者
邓东灵
孔庆涛
+5 位作者
胡青原
刘海波
魏天彪
黄善青
陈浩
桑红
《医学研究生学报》
CAS
北大核心
2019年第3期241-247,共7页
目的胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)可激活核因子?κB(NF?κB)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等通路参与免疫,但其作用机制至今尚未阐明。为进行相关体外实验,构建CARD9?麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并对融合蛋白进行表达...
目的胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)可激活核因子?κB(NF?κB)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等通路参与免疫,但其作用机制至今尚未阐明。为进行相关体外实验,构建CARD9?麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并对融合蛋白进行表达鉴定及纯化。方法利用PCR技术分别扩增CARD9和MBP基因的编码序列,将两者正确插入pET?30a(+)载体中得到重组质粒,后转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中,并进行PCR和酶切鉴定以及基因测序。将正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,筛选不同条件进行IPTG诱导表达,通过SDS?PAGE电泳检测目的蛋白质的相对分子质量。通过MBP麦芽糖层析柱和分子筛层析柱对CARD9?MBP融合蛋白进行纯化,用HRV3C蛋白酶酶切去除MBP标签后进行MALDI?TOF质谱鉴定。结果成功构建CARD9?MBP融合蛋白的原核表达载体,PCR和酶切鉴定为阳性且基因测序结果与目的序列一致。SDS?PAGE电泳显示,在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功诱导表达出相对分子质量约为105 000的目的蛋白。通过MBP麦芽糖层析柱的初步纯化后,可得到相对较纯的融合目的蛋白,经HRV3C蛋白酶酶切去除MBP标签后行MALDI?TOF质谱鉴定其确为CARD9蛋白。后期通过分子筛层析柱进一步纯化得到了更纯的CARD9?MBP融合蛋白。结论成功构建了重组CARD9?MBP融合蛋白的原核表达载体,并进行了大量可溶性表达。通过MBP麦芽糖层析柱和分子筛层析柱的纯化,可得到较纯的目的蛋白。
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关键词
胱天蛋白酶募集域蛋白9
原核表达
MBP麦芽糖层析柱
分子筛层析
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职称材料
题名
胱天蛋白酶募集域蛋白9?麦芽糖结合蛋白融合蛋白的原核表达及纯化
被引量:
3
1
作者
邓东灵
孔庆涛
胡青原
刘海波
魏天彪
黄善青
陈浩
桑红
机构
东部战区总医院(原南京军区南京总医院)皮肤科
南京大学化学化工学院配位化学国家重点实验室
出处
《医学研究生学报》
CAS
北大核心
2019年第3期241-247,共7页
基金
江苏省皮肤病学创新团队项目(CXTDA2017038)
文摘
目的胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)可激活核因子?κB(NF?κB)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等通路参与免疫,但其作用机制至今尚未阐明。为进行相关体外实验,构建CARD9?麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并对融合蛋白进行表达鉴定及纯化。方法利用PCR技术分别扩增CARD9和MBP基因的编码序列,将两者正确插入pET?30a(+)载体中得到重组质粒,后转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中,并进行PCR和酶切鉴定以及基因测序。将正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,筛选不同条件进行IPTG诱导表达,通过SDS?PAGE电泳检测目的蛋白质的相对分子质量。通过MBP麦芽糖层析柱和分子筛层析柱对CARD9?MBP融合蛋白进行纯化,用HRV3C蛋白酶酶切去除MBP标签后进行MALDI?TOF质谱鉴定。结果成功构建CARD9?MBP融合蛋白的原核表达载体,PCR和酶切鉴定为阳性且基因测序结果与目的序列一致。SDS?PAGE电泳显示,在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功诱导表达出相对分子质量约为105 000的目的蛋白。通过MBP麦芽糖层析柱的初步纯化后,可得到相对较纯的融合目的蛋白,经HRV3C蛋白酶酶切去除MBP标签后行MALDI?TOF质谱鉴定其确为CARD9蛋白。后期通过分子筛层析柱进一步纯化得到了更纯的CARD9?MBP融合蛋白。结论成功构建了重组CARD9?MBP融合蛋白的原核表达载体,并进行了大量可溶性表达。通过MBP麦芽糖层析柱和分子筛层析柱的纯化,可得到较纯的目的蛋白。
关键词
胱天蛋白酶募集域蛋白9
原核表达
MBP麦芽糖层析柱
分子筛层析
Keywords
caspase recruitment domain‐containing protein 9
prokaryotic expression
MBP maltose chromatography column
gel filtration chromatography column
分类号
R34 [医药卫生—基础医学]
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题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
胱天蛋白酶募集域蛋白9?麦芽糖结合蛋白融合蛋白的原核表达及纯化
邓东灵
孔庆涛
胡青原
刘海波
魏天彪
黄善青
陈浩
桑红
《医学研究生学报》
CAS
北大核心
2019
3
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职称材料
已选择
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参考文献
引证文献
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