共检猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒的cDNA芯片的技术优化

【目的】对前期构建的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和A型猪轮状病毒(PoRVA)共检cDNA芯片进行技术创新和关键参数优化。【方法】根据靶基因PEDV(S和M)、TGEV(N和S)以及PoRVA的(VP7和NSP4)分别设计6对特异性引物,扩增探针制备芯片阵列。重点改进了样品标记技术,引物直接标记与不对称PCR扩增结合,确定了不对称PCR扩增体系;并对点样缓冲液、水合时间、探针浓度、杂交时间和温度、清洗和干燥方式等条件进行优化。【结果】当博奥和百傲两种缓冲液比例为1∶1,水合时间为4 s,探针浓度为600 ng/μL,不对称PCR上下游引物比为1∶40,在48℃杂交3 h,用0.2%SDS清洗,1 000 r/min离心,该cDNA芯片效果最佳。【结论】本研究确定了PEDV-TGEV-GAR共检cDNA芯片的关键技术参数,为开展基因芯片的标准化制备和应用奠定了基础。

猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot验证兔抗血清特异性,间接ELISA测定抗血清效价。利用间接免疫荧光试验(IFA)、免疫荧光试验(IF)、流式细胞术(FCM)鉴定其诊断应用价值。重组N蛋白为可溶性表达,大小约为44 kD,制备的兔抗N蛋白抗体效价可达1∶204800。IFA与FCM试验证实该抗体能与PDCoV特异性结合,与PEDV及TGEV无交叉反应,IF试验表明该抗体可用于检测小肠组织中的PDCoV。

“微文化”背景下新闻客观性缺失的原因与对策探析

在"全民传播"的"微时代",由于新闻发布者专业素养的力有未逮,传统主流媒体职业操守不足的推波助燃,相关部门监督体制尚未完善监管的无力,网民窥探欲与表达欲强烈的滥加评论等原因,自媒体传播也不可避免地造成微时代新闻客观性的缺失。因此,需坚持马克思主义新闻观指导思想,强化新闻"把关人"的监督管理,制定自媒体平台用户言论规范,提高微时代的新闻客观性。

不同动物源性细胞系对猪丁型冠状病毒的易感性

【目的】探究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)能否在不同动物源性细胞系中感染和增殖。【方法】本研究将PDCoV四川分离株CHN-SC2015接种来自仓鼠、家禽、猴、人和猪的12种细胞系,将病毒在每种细胞系中盲传至少5代并通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、间接免疫荧光试验(IFA)和测序鉴定。【结果】PDCoV在Vero、PAM、PK15、ST和LLC-PK1细胞中的P1表现出明显的细胞病变效应(CPE),且在PAM、PK15、ST和LLC-PK1细胞上有不同程度的增殖,但在Vero和PAM细胞的后续传代中CPE逐渐消失;除3种易感细胞外(PK15、LLC-PK1和ST),病毒拷贝数随着传代次数的增加而逐渐降低,而在DEF、Marc-145、HEK-293、ZYM-SIEC02和PAM细胞的P4或P5中不能检测到PDCoV;PCR结果显示,只有在CEF和Vero细胞的P5中还能检测到PDCoV;IFA的结果表明,PDCoV可以感染除BHK-21和ZYM-SIEC02以外的大多数细胞,在PK15、LLC-PK1和ST细胞的P1、P3和P9均可以观察到特异性免疫荧光,因此仅3种细胞系(PK15、LLC-PK1和ST)适合病毒的连续传代,在P9病毒滴度分别可达10^(7.11)、10^(7.00)和10^(7.37) TCID_(50)/mL;在不同的细胞系中传代后,PDCoV的S基因序列累计有14个核苷酸和相应的12个氨基酸突变。【结论】本研究表明,PDCoV可在体外感染多种细胞,提示其可能存在跨种传播潜力。