利用CRISPR/Cas9探究水稻OsPIN5c基因功能

生长素极性运输在植物生长发育中发挥着重要作用,生长素输出载体蛋白(PIN-FORMED,PIN)是控制生长素极性运输的关键蛋白。虽然部分水稻OsPIN基因功能已有报道,但水稻OsPIN5c的生物学功能仍有待研究。本研究在OsPIN5c第1外显子处设计靶点并构建CRISPR/Cas9载体,通过转化粳稻品种日本晴获得24株转基因植株,PCR产物直接测序分析表明其中15株发生突变,突变率为62.5%,突变类型为双等位突变;进一步从T1代突变体中筛选获得3种不同的纯合突变体,将其命名为ospin5c-1、ospin5c-2和ospin5c-3。序列比对分析表明,这3种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止,由原来的398个氨基酸分别缩短为109、106和250个氨基酸;跨膜螺旋结构域分析表明,3种突变体中OsPIN5c蛋白的跨膜结构完全消失;蛋白结构预测表明3种突变体中OsPIN5c蛋白螺旋结构明显减少。突变体的苗高、根长和不定根数均显著低于野生型植株。组织特异性表达表明OsPIN5c主要在根中表达。突变体根中OsPIN1a和OsPIN5b表达量提高;生长素合成关键基因OsYUC1、OsYUC4、OsYUC6和OsYUC7的表达量也显著提高。ospin5c突变体根的向重性受到部分抑制。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得ospin5c纯合突变体并探讨了OsPIN5c基因功能,为利用OsPIN5c基因进行作物遗传改良提供了潜在的基因资源。

OsPIN1a基因在水稻根负向光性中的作用初探

为了探讨水稻生长素输出载体蛋白OsPIN1a与根负向光性的关系,根据GenBank数据库报道的OsPIN1a核苷酸序列,利用RT-PCR技术,设计特异引物从水稻cDNA中扩增得到生长素输出蛋白基因(OsPIN1a)。测序结果表明,OsPIN1a基因序列中GC含量达65.49%。构建该基因的GFP融合表达载体pCAMBIA-1301-OsPIN1a::GFP,对洋葱表皮细胞的瞬时表达分析表明,融合蛋白主要分布在细胞膜和细胞核内。以农杆菌介导法转化水稻中花11,PCR和GUS染色检测结果表明,目的基因片段已经整合到水稻基因组内;在单侧光照射下,转基因水稻种子根的负向光弯曲角度比野生型大约14.0%,转基因植株中OsPIN1a的表达水平也显著高于野生型植株,说明OsPIN1a可能在水稻根的负向光性反应中起重要作用。

水稻Rubisco小亚基启动子的克隆及光诱导表达载体的构建

高效特异表达的启动子往往是转基因研究的关键因素。Rubisco小亚基启动子具有光诱导性、组织特异性和高表达的特性,可利用该启动子为转基因研究服务。本文以水稻(Oryza sativa)中花11叶片为材料,根据GenBank所报道的水稻Rubisco小亚基启动子序列,设计特异引物从水稻基因组DNA中扩增得到长度约1600bp的DNA片段,将该片段连接至T载体pMD18-TSimple,测序结果表明该片段序列与GenBank报道序列一致为100%。Plant CARE序列分析表明,该启动子具有12个与光诱导表达相关的元件。为构建光诱导表达载体,将该启动子和植物表达载体pCactF分别以KpnⅠ和XbaⅠ酶切后连接。光诱导表达载体的构建为进一步研究基因功能及利用光诱导表达载体改良作物品质奠定基础。

光呼吸突变体研究进展

光呼吸(photorespiration)是绿色植物在光下吸收氧气并释放CO2的过程。C3植物光呼吸可消耗25%光合产物,故合理改良光呼吸可望提高植物的光合效率。筛选与利用光呼吸突变体是研究光呼吸代谢及其功能的最为有效的途径。该文对光呼吸代谢途径、光呼吸突变体的筛选以及研究进展进行综述,以期为深入探讨植物光呼吸的生物学功能及进行植物分子改良提供帮助。

几种抑制剂对水稻种子根负向光性的影响

以籼稻品种湘中籼2号种子为材料,研究了生长素极性运输抑制剂N-1-萘基邻氨甲酰苯甲酸(N-1-Naphthylphthalamic acid,NPA)和钙离子通道抑制剂(GdCl3)对水稻种子根负向光性的影响。结果表明,随着NPA和GdCl3浓度的增大和处理时间的延长,根的负向光性逐渐受到抑制,外施一定浓度的CaCl2可以部分恢复水稻种子根的负向光性;根尖的生长素含量与黑暗的相比没有差异,推测水稻种子根负向光性的形成是生长素的极性运输造成的,而钙离子作为生长素下游的第二信使,可能参与调控水稻种子根负向光性的形成。

乙醇酸氧化酶基因超表达载体的构建与水稻的遗传转化

通过RT-PCR从水稻cDNA中扩增得到乙醇酸氧化酶基因(GLO)的完整序列。构建组成型超表达载体并转化水稻,经初步PCR和Southern杂交检测,确认已得到超表达转基因植株。酶活检测表明,其GLO活性最高可提高约70%。GLO基因超表达植株的获得为进一步研究GLO以及光呼吸的生理功能奠定了基础。

水稻OsPIN1b基因GFP融合表达载体构建及转化水稻的研究

水稻生长素输出载体OsPIN1a可能参与调控水稻根负向光性反应。为了进一步研究其他OsPIN基因与水稻根负向光性的关系,以GenBank数据库报道的OsPIN1b核苷酸序列为基础,设计特异引物以RTPCR从水稻cDNA中扩增得到OsPIN1b基因。测序结果表明获得完整的OsPIN1b基因ORF序列;生物信息学分析表明,OsPIN1b基因序列全长1 665 bp,与已报道的序列相吻合,其GC含量为64.08%,编码554个氨基酸。进一步构建了该基因的GFP融合表达载体pCAMBIA-1301-OsPIN1b∷GFP并转化水稻中花11,分子检测和GUS染色表明外源片段已经成功整合到水稻基因组,为研究OsPIN1b在水稻根负向光性中的作用奠定基础。

河南科技大学“植物生理学综合性实验”课程开设探讨

为了克服传统本科生实验教学中学生对实验过程理解不全面、动手和思考分析能力提升不足的缺陷,河南科技大学特开展为期一周的植物生理学综合性实验课程。实验教学采用启发式教学,通过设置一系列涵盖植物生长、物质代谢和抗性生理等内容的实验,充分发挥学生的主观能动性,调动学生的积极性,尽可能让学生独立完成实验过程。实施结果表明,植物生理学综合性实验课程既能提高学生分析问题和解决问题的能力,又能培养学生的探索精神。

生物学课堂教学中本科生科研素质培养的探讨

生物学的快速发展对本科生的科研素质提出了更高的要求。通过在植物生理学课堂教学中向学生介绍科学引文索引、专业学习网站、著名学者和实用技术等途径,激发了学生的学习兴趣,提高了学生资料查阅和撰写科技论文等科研素质。

乙醇酸氧化酶基因诱导反义表达载体的构建与水稻的遗传转化

通过RT-PCR扩增得到水稻叶片乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase,GLO)的全长cDNA并构建诱导反义表达载体pER8-GLO,以根癌农杆菌介导法得到转基因水稻。以诱导剂β-雌二醇(β-estradiol)诱导处理12 d后,转基因水稻的GLO活性降低超过80%。在空气条件下,转基因植株的生长受到抑制;而高CO2条件下的转基因植株与野生型植株表型没有显著差异,说明反义GLO植株具有典型的光呼吸突变体的特征。

谈提高生物技术概论教学质量的几点体会

生物技术是一门涉及领域宽、涵盖范围广、基础性强的新兴生物学科,是现代生物学发展并与相关学科交叉融合的产物。近年来,随着分子生物学突飞猛进的发展,新理论、新技术层出不穷,给生物技术教学带来了极大挑战。为了提高教学质量,帮助学生进一步掌握和提高生物技术理论知识和实验技能,我们在本科生生物技术的教学内容、教学方法、实验安排等诸多方面进行了探索,达到良好的教学效果。

集胞藻PCC6803乙醇酸脱氢酶基因的克隆及其叶绿体定位分析

为明确集胞藻PCC6803乙醇酸脱氢酶与水稻Rubisco小亚基叶绿体转运肽(RCTP)的融合蛋白是否能准确定位到水稻叶绿体,本研究以特异引物从集胞藻PCC6803基因组DNA中扩增获得约1.5 kb的片段,将该片段与水稻Rubisco小亚基叶绿体转运肽连接,然后将融合片段连入瞬时表达载体P322-d1-e GFP,测序,获得融合基因RCTP-gdh,进一步构建了叶绿体定位的瞬时表达载体RCTPGDH-e GFP-d1并进行了叶绿体定位研究。结果表明,集胞藻PCC6803 GDH共编码492个氨基酸,含有FAD结合域、FAD关联的氧化酶活性(222~464 aa)以及乙醇酸氧化酶亚基(51~463 aa)。激光共聚焦显微镜分析表明,融合蛋白RCTP-GDH-e GFP可以准确定位到水稻叶绿体,但其转运效率低于RCTP-e GFP的转运效率,叶绿体和细胞质中的融合蛋白RCTP-GDH-e GFP都易于聚集而呈斑点状。本研究为进一步应用集胞藻gdh基因改造C3作物光呼吸代谢途径,抑制C3作物光呼吸速率,提高作物光合速率奠定了基础。

蜡处理对沙糖桔贮藏期间果实的影响

以无核沙糖桔果实为材料,研究了不同蜡处理对常温贮藏果实品质、乙醛和乙醇含量、丙酮酸脱氢酶(PDC)和乙醇脱氢酶(ADH)活性的影响。结果表明:涂蜡和0.5%、1%蜡液处理均降低了果实腐烂率和失重率,涂蜡果实在42 d时仍保持较高的果汁TSS、TA和Vc含量。贮藏30 d后涂蜡果实的PDC、ADH活性和乙醇、乙醛含量明显增加,且显著高于浸蜡处理的果实,果实仍保持良好的风味。

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3（AP3）在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育。研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子。因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用。本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）AP3基因启动子序列（U30729）设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plusDNA聚合酶扩增了长度为1767bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其Gen-Bank登录号为FJ619533。Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18（AL132971）9264~11030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白（CAB81799）,说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子。PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等。本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3：：GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。

防腐剂结合蜡处理对沙糖桔贮藏保鲜效果的影响研究

以无核沙糖桔果实为材料,研究了多菌灵、施保功及特克多与2,4-D、果蜡等组合的防腐保鲜剂配方对常温贮藏果实好果率和品质的影响。结果表明,稀释蜡液处理以0.010%2,4-D+0.025%特克多+0.50%蜡液的效果最好,贮后60 d的好果率为95.0%;果蜡原液处理以0.010%2,4-D+0.100%施保功+果蜡原液的效果最好,贮后60 d的好果率为95.3%。研究结果还表明,2种防腐保鲜剂配方能有效地保持沙糖桔果汁可溶性固形物、维生素C和可滴定酸的含量,减少果实的失重。

基于ITS2序列的獐牙菜属六种药材的分子鉴定

本文以獐牙菜属的六种药材为研究对象,采用MEGA 6.0软件确定ITS2序列的GC含量,基于K2P模型计算遗传距离,构建NJ树,ITS2 database在线分析二级结构等方法,研究ITS2条形码序列对六种药材的鉴别效果。结果表明,六种药材的ITS2序列长度范围为230~232 bp,平均GC含量为61.2%~64.0%。六种药材的种内变异均较小,其种间平均遗传距离为0.03~0.09。ITS2二级结构的茎环结构和四个臂均不同,NJ树结果显示,六种药材可分别聚为一支,呈现出明显的单系性。因此,ITS2序列可准确、有效地鉴别本研究的獐牙菜属六种药材,为这些药材的后续相关深入研究奠定了基础,也为獐牙菜属其他物种鉴定提供了参考。

钙信号试剂对水稻种子根负向光性生长的影响

为了探讨水稻根负向光性形成与钙信号传导的关系,以水稻种子根为材料,用不同浓度的钙信号试剂[氯化钙、钙通道有机阻断剂异搏定、钙通道无机阻断剂氯化镧、钙调素抑制剂氯丙嗪(CPZ)以及生长素极性运输抑制剂NPA]处理水稻种子根,以1/10Hoagland培养液为对照,并用100～200μmol/(m2.s)单侧光照射24h。实验结果表明,适量的CaCl2使水稻种子根负向光性增强并使其生长加快,负向光性增强是由于外源Ca2+进一步促进生长素从向光侧向背光侧运输引起的,与生长速率加快无关;同时,随着钙通道有机阻断剂、无机阻断剂、钙调素抑制剂以及生长素极性运输抑制剂浓度的上升,水稻根的负向光性及生长均受显著抑制,当异搏定的浓度大于100μmol/L,LaCl3的浓度大于12.5μmol/L,负向光性消失,种子根的生长也受到严重的影响;而60μmol/L钙调素抑制剂氯丙嗪、6μmol/L生长素极性运输抑制剂NPA也使得根负向光性消失,根的生长几乎停止;向LaCl3溶液、异搏定溶液以及NPA溶液中添加100μmol/L CaCl2可使负向光性及生长速率得到不同程度的恢复,表明钙离子作为第二信使系统,与生长素相互作用,参与光信号调控水稻根生长和负向光性形成。

生物信息学课程教学改革与探索

生物信息学是一门理论性和实践性都很强的课程,理论与实践的结合十分紧密。基于课程特点,对生物信息学课程教学进行了改革和探索。采用循序渐进的方式,激发学生的学习兴趣,应用双语多媒体方式教学,在重视基本理论和基本知识讲授的基础上,加强上机实践操作,充分利用网络教学资源,有机地将科研成果应用于教学过程中,并对考试方式进行了改进。这些改革措施调动了学生学习的积极性和主动性,提高了学生生物信息学分析的技能和创新能力,取得了良好的教学效果。

纳米硅对Cd胁迫下水稻幼苗γ-ECS基因表达的影响

为了探明外源纳米硅对缓解植物Cd毒害的分子机制,本文以核基因延伸因子(EF-1α)作为内参,利用半定量反转录聚合酶链式反应技术,对Cd胁迫下的水稻γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)基因的表达进行了研究。结果发现:γ-ECS基因在水稻的叶、根中均表达,外源纳米硅不同时间处理后水稻叶片和根中γ-ECS基因的表达稍微有所增强。研究表明,用半定量RT-PCR技术研究水稻基因表达,具有特异性高、操作简便和可靠性强的优点。

非生物胁迫下水稻OsMATE基因表达分析

从水稻(Oryza sativa L.)叶片中克隆到与高粱(Sorghum bicolor)SbMATE最相似的同源基因OsMATE,利用半定量RT-PCR分析了OsMATE在水稻不同组织、不同非生物胁迫以及抗铝和铝敏感水稻品种中的表达。结果表明,OsMATE在水稻根和叶中表达非常低,叶鞘中几乎没有表达;铝、镉、砷、盐、铁、PEG6000、百草枯和ABA等非生物胁迫都可以诱导水稻根OsMATE的大量表达,而在水稻叶中,只有砷、盐和PEG6000可以少量诱导OsMATE的表达;并且铝毒胁迫下抗铝品种根中OsMATE的表达明显高于铝敏感品种。这说明非生物胁迫下OsMATE在水稻抗逆中可能发挥重要作用。