三疣梭子蟹IAG基因的原核表达及质谱鉴定

基于已知的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)胰岛素样促雄腺激素(IAG)序列,对其ORF区域进行扩增,并连接至pET-22b、pET-28a和pET-28a-sumo等不同的原核表达载体中,随后分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)与Rosetta(DE3)。通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达带有His标签的IAG重组融合蛋白,发现仅pET-28a-sumo-IAG有可见表达,且转化至Rosetta(DE3)菌株的IAG重组蛋白表达量较高。进一步对Rosetta-pET-28a-sumo-IAG的表达条件进行优化,发现IPTG终浓度为0.6 mmol/L,16℃诱导16 h后重组蛋白表达量最大。制备的融合蛋白主要以可溶性形式高效表达,通过HisTrap HP柱进行纯化后,经Western Blot分析发现该融合蛋白可与鼠抗His-tag多克隆抗体发生特异性结合。将制备的蛋白进行质谱分析,得到的2条肽段能够分别与三疣梭子蟹的B链和A链相匹配,表明重组融合蛋白表达成功。