猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达及其免疫原性分析

为了表达猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳(Cap)蛋白,分析其免疫原性,本试验构建了不包含Cap蛋白核定位序列的原核表达质粒pET-28a-PCV3-Cap,应用大肠杆菌Escherichia coli表达系统诱导表达了重组Cap蛋白;通过SDS-PAGE、Western Blot及液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术对表达蛋白进行了鉴定;分析预测了蛋白的抗原表位,并通过动物试验分析蛋白的免疫原性。结果显示,在31℃下经0.5 mmol/L的IPTG诱导4 h,蛋白(25.4 kDa)表达量最高,其主要以包涵体形式表达;表达蛋白与PCV3参考毒株Cap蛋白氨基酸序列的一致性为88.4%(152/172 aa),并且预测的抗原表位与参考毒株的相符;重组蛋白能够刺激小鼠产生特异性抗体,平均抗体水平≥1∶12800。上述结果表明,表达的蛋白具有良好的免疫原性。该试验为深入解析PCV3-Cap蛋白抗原表位的免疫活性以及相关亚单位疫苗和特异性抗体检测技术的研究提供了科学依据。

基于非洲猪瘟病毒p30蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

p30是非洲猪瘟病毒(Africa swine fever virus,ASFV)感染早期表达的结构蛋白,为非洲猪瘟(ASF)早期诊断和抗体监测的重要靶标。为了建立ASFV ELISA抗体检测方法,本试验以重组p30作为检测抗原,通过方阵滴定法优化抗原包被质量浓度、封闭液以及待检血清和酶标抗体的稀释倍数;确立阴、阳性临界值,检测方法的特异性、敏感性和重复性;比较ELISA方法与商品试剂盒检测结果的符合率,并用Western blot对ELISA结果进行了验证。结果显示,ELISA方法的最佳抗原包被质量浓度为1 mg/L,封闭液为5%的脱脂奶粉,待检血清与酶标抗体的稀释倍数分别为1∶100和1∶5000倍,阴、阳性临界值为0.294。该方法与伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒等抗血清无交叉反应,敏感性高于商品试剂盒,批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.723%和4.923%。初步应用显示,建立的ELISA方法的血清抗体阳性检出率高于商品试剂盒,两者的总符合率为62.1%。进一步验证表明,建立的ELISA方法与Western blot的结果一致。上述结果表明,建立的ELISA方法具有良好特异性、重复性及更高的敏感性,可以为ASF的早期诊断、感染猪筛查及其有效防控提供重要技术支持。

鉴别PRRSV经典、高致病性和类NADC30毒株PCR方法的建立及初步应用

为了建立鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory virus,PRRSV)经典毒株、高致病性毒株与类NADC30毒株的快速检测方法,根据不同毒株的ORF1a核苷酸序列,设计并合成PRRSV特异性引物。经过引物筛选以及对退火温度、引物浓度的优化,建立了应用1对引物鉴别检测经典、高致病性及类NADC30 PRRSV毒株的PCR方法。该方法的反应体系为20μL,退火温度为58°C,引物含量为10 pmol,对经典毒株、高致病毒株和类NADC30毒株cDNA的最低检出量分别为12.16、138.70和59.30 pg;对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等的检测均为阴性。进而用建立的PCR方法检测2017-2019年采集的38份PRRSV阳性组织病料,结果PRRSV总检出率为100%,其中类NADC30毒株、高致病性毒株与经典毒株的检出率分别为89.5%(34/38)、26.3%(10/38)和7.9%(3/38),并检测到2种或3种不同PRRSV毒株混合感染样本。该检测结果表明,建立的PCR方法可以用于PRRSV感染临床病例的检测,提示当前河北省部分地区猪场类NADC30毒株已成为优势流行毒株,不同PRRSV毒株的混合感染状态复杂多样。