副结核分枝杆菌胞外GDSL脂肪酶MAP_2739的酶学特性研究

本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP)GDSL脂肪酶家族蛋白MAP_2739。为进一步分析MAP_2739的酶学特性,本实验利用生物信息学网站和软件对MAP_2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析,进一步确认其属于GDSL脂肪酶家族蛋白。以MAP参考株基因组DNA为模板,PCR扩增获得map_2739目的基因约891 bp,克隆于表达载体pET-22b中,构建重组质粒pET-22b-map_2739,转化大肠杆菌感受态细胞,经IPTG诱导表达、蛋白复性、Ni-TNA柱亲和层析纯化后,利用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达及纯化效果,并通过western blot鉴定。结果显示,获得了以包涵体形式表达的经复性的纯化重组MAP_2739蛋白(rMAP_2739)。利用该蛋白制备兔多克隆抗体,通过ELISA方法检测,多抗血清效价为1∶51200。经差速离心法分离MAP参考株组分,利用该多克隆抗体为一抗,通过western blot检测,结果显示在细胞壁、细胞膜和细胞浆均出现35 ku的特异性条带,表明MAP_2739为胞外蛋白。以对硝基苯基酯(p-NPs)为底物进行酶活测定,结果显示MAP_2739蛋白为脂肪酶,可水解短链和长链脂肪酸,其最适酶反应pH值为9.0,且rMAP_2739蛋白经巴氏消毒法预处理后,仍具有脂肪酶活性。以重组质粒pET-22b-map_2739为模板,利用各定点突变引物,经PCR扩增各突变的map_2739基因,并测序后转化大肠杆菌感受态细胞,通过western blot鉴定蛋白表达及纯化情况,并进行了酶活测定分析,结果显示获得各定点突变纯化蛋白,确定S46和D204为MAP_2739的酶活性位点。综上所述,本研究首次证明MAP_2739是MAP胞外GDSL脂肪酶,该结果为进一步研究其在MAP致病中的作用机制奠定了基础。

结核分枝杆菌复合群、副结核分枝杆菌和禽分枝杆菌禽亚种多重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

结核分枝杆菌复合群(MTBC)、包括结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等;非结核分枝杆菌(NTM)中禽分枝杆菌(MA)是自然界常见的动物致病菌,包含4个亚种,分别为禽分枝杆菌禽亚种(MAA)、禽分枝杆菌人/猪亚种(MAH)、禽分枝杆菌副结核亚种/副结核分枝杆菌(MAP)和禽分枝杆菌森林土壤亚种(MAS)。为建立MTBC、MAP和MAA的多重荧光定量PCR检测方法,本研究基于MTBC、MAP和MAA的特异性基因devR、F57和IS901分别设计引物及探针,通过优化各反应条件,建立了一种可同时检测3种分枝杆菌的多重Taq Man荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对MTB、MB、MAP、MAA和MAS检测为阳性,对其他畜禽病原菌,包括MAH、13种NTM和7种非分枝杆菌检测结果均为阴性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对MB、MAP和MAA重组质粒标准品的检测限均为1.0拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,批内与批间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法检测体外模拟污染(MB、MAP和MAA菌液浓度分别为1.0×10^(3)cfu/mL~1.0×10^(0)cfu/mL)的27份牛抗凝血和12份牛淋巴结组织样品,确定该方法对3种菌的检测限,结果显示该方法对3种菌的检测限均为1.0 cfu/mL~10.0 cfu/mL。将浓度为1.0×10^(6)cfu/mL的MB、MAP和MAA菌液分别单一、两两混合、三种菌混合感染BALB/c小鼠,5 d后,剖杀各组小鼠并取各组织及血液样品,同时采用该方法、常规单一PCR及细菌分离培养方法检测,比较三者的检测结果。结果显示,多重荧光定量PCR方法对不同感染组小鼠的各组织样品检出率为98.1%(212/216),常规单一PCR方法的检出率为81.5%(176/216),细菌分离培养的检出率为52.8%(114/216),多重荧光定量PCR与常规单一PCR的阳性符合率均为100.0%(176/176),与细菌分离培养鉴定结果的阳性符合率均为100.0%(114/114)。本研究首次建立了能够同时检测MTBC、MAP和MAA的Taq Man多重荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性及稳定性好,检测性能强,可以用于临床各种样品的检测,为这3种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

副结核分枝杆菌MAP1068胞外蛋白酶的特性研究

为研究副结核分枝杆菌(MAP)1068蛋白的特性,本研究以MAP参考株K10基因组为模板,PCR扩增其map1068基因,构建p ET28a-map1068重组载体,将其转化BL21后诱导表达并纯化MAP1068蛋白。利用纯化的重组蛋白免疫(100μg/只/0.1 m L)小鼠制备多克隆抗体,应用该抗体对MAP1068蛋白进行亚细胞定位。以酪蛋白为底物测定MAP1068蛋白的酶活性。结果显示,MAP1068蛋白以包涵体形式表达;经变性、复性、亲和层析纯化后获得目的蛋白;将该蛋白免疫小鼠后其血清抗体效价可达1∶204 800;该蛋白主要定位于MAP细胞壁,可降解酪蛋白,为胞外蛋白酶。本实验为进一步研究MAP的致病机制奠定了基础。

耻垢分枝杆菌诱导中性粒细胞胞外诱捕网形成的研究

中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是中性粒细胞抵御病原微生物重要的防御机制之一,NETs能够在体内外条件下捕获并杀灭病原微生物。为研究模式菌株-耻垢分枝杆菌(MS)与中性粒细胞的相互作用,本研究通过分离牛外周血中性粒细胞,将标记红色荧光的MS与中性粒细胞共孵育,通过激光共聚焦观察NETs的形成;采用Pi-coGreen~?dsDNA试剂盒定量分析胞外ds DNA的释放量;并且通过菌落计数统计MS的存活情况。结果显示,MS能够诱导中性粒细胞形成NETs,胞外游离DNA的释放量随着时间的延长而逐渐增多,与对照组相比差异极显著(p<0.01或p<0.001),且NETs能够杀灭MS。本研究为后续利用MS作为模式菌研究结核分枝杆菌重要蛋白功能的研究提供参考依据。

黑龙江某规模化牛场副结核分枝杆菌的分离与鉴定

为检测黑龙江某规模化牛场副结核病的感染情况,本研究采集了35头副结核分枝杆菌(MAP)抗体阳性牛(有腹泻表现)的直肠刮取物,采用IS900-PCR鉴定样品中的MAP,将该PCR扩增为阳性的样品通过细菌分离培养、菌落形态学观察、多重PCR鉴定MAP的亚型,通过IS1311基因序列同源性比对并对分离菌进行遗传进化分析,同时对其进行多态性分型鉴定,进一步确定分离株的亚型。结果显示,35份直肠刮取物样本中,31份经IS900-PCR扩增阳性,分离培养得到的3株分离菌菌落形态与分枝杆菌相似,多重PCR的鉴定谱型均与MAP K-10参考株一致,其在遗传进化上与多株MAP具有高度的亲缘性,经IS1311多态性分型鉴定3株分离菌均为牛型MAP,分别命名为MAP-HLJB160、MAP-HLJB175、MAP-HLJB177。本研究为黑龙江地区副结核病的预防和流行病学调查提供数据支撑。