MSTN基因编辑湖羊胫腓肌的转录组分析

[目的]本文旨在探索肌肉抑制素基因(myostatin,MSTN)调控肌肉生长发育的分子机制。[方法]以3月龄MSTN基因编辑湖羊(试验组)和野生型湖羊(对照组)胫腓肌为对象,采用PCR和Western blot方法验证MSTN编辑湖羊编辑形式,在此基础上开展转录组测序和分析,并用real-time PCR方法对差异表达基因进行结果验证。[结果]对照组和试验组共有149个差异表达基因,其中65个基因上调,84个基因下调,GO注释和KEGG富集分析表明,差异表达基因显著富集在氧化磷酸化、果糖和甘露糖代谢、生热作用、FOXO和AMPK信号通路,表明MSTN基因可能通过以上信号通路参与湖羊生长发育调控。[结论]MSTN基因编辑湖羊可能通过FOXO和AMPK、氧化磷酸化、果糖和甘露糖代谢、生热作用等与动物代谢相关的信号通路调控其生长发育。

补饲胆固醇对高温环境下湖羊母羊繁殖性能和血清生化指标的影响

【目的】研究饲粮中添加胆固醇对中国南方夏季湖羊发情率、受胎率和血清生化指标的影响。【方法】选择108只体重相近(33.60 kg±1.86 kg)的健康湖羊母羊,其中30只湖羊在非高温季节(4月份,平均最高温度20.9℃±3.2℃)饲粮添加不同剂量胆固醇(0.1%和0.5%),ELISA方法检测血清中胆固醇含量的动态变化,筛选合适的胆固醇添加量;另外78只湖羊随机分成2组(对照组和试验组),试验期63 d(从同期发情处理第1天到自然发情后配种的第30天),在夏季高温季节(7-9月份,平均最高温度31.3℃±2.6℃),对照组饲喂基础饲粮,试验组饲喂添加0.1%胆固醇的基础饲粮,ELISA方法检测血清中雌二醇(E2)和孕酮(P4)水平,研究饲粮添加胆固醇对湖羊发情率、受胎率和血清生化指标的影响。【结果】非高温季节湖羊基础饲粮中分别添加0.1%和0.5%胆固醇,48 h后两组湖羊血清中胆固醇含量趋于一致,据此选择0.1%作为高温季节补饲胆固醇的添加剂量。夏季高温季节在补饲0.1%胆固醇的第3、30和63天均能显著提高湖羊血清中胆固醇含量(P<0.05);且试验组湖羊自然发情率(89.7%)高于对照组(82.1%)(P>0.05),受胎率(60.0%)显著高于对照组(46.9%)(P<0.05)。试验组湖羊总蛋白、球蛋白、白细胞介素-1和甘油三酯含量均显著高于对照组(P<0.05),而尿素氮含量显著下降(P<0.05)。【结论】夏季高温环境下,在湖羊母羊饲粮中添加0.1%胆固醇可有效提高其发情率和受胎率。

湖羊lncRNA-269的鉴定及转录调控分析

[目的]本文旨在研究湖羊长链非编码RNA-269(long no-coding RNA-269,lncRNA-269)序列特征、表达模式和转录调控,为后续开展lncRNA-269的功能研究提供理论基础。[方法]以湖羊为研究对象,采用5′/3′RACE结合PCR扩增方法获得其序列全长,利用RT-qPCR方法鉴定其在湖羊组织中的表达模式,并利用PCR方法扩增其启动子区,鉴定其启动子区特征,分析其转录调控情况。[结果]湖羊lncRNA-269全长3 146 bp,组织表达谱显示其在湖羊各组织中广泛表达,且在健康卵泡中显著高表达,其表达水平与NR5A1 mRNA水平和血清中雌二醇(E_(2))水平呈正相关。荧光素酶活性分析发现在lncRNA-269启动子区的-359~-17 nt有1个转录激活基序,在-1 485~-942 nt有1个转录抑制基序。JASPAR软件预测发现在lncRNA-269转录抑制启动子区域存在FOXO3、PDX1等转录因子结合位点,在转录激活区域有SMAD4、YY1等转录因子结合位点。过表达SMAD4可显著提升lncRNA-269启动子区荧光素酶活性,染色质免疫沉淀(ChIP)-PCR试验进一步确认了SMAD4特异性与lncRNA-269启动子区结合。[结论]湖羊lncRNA-269在健康卵泡中显著高表达,其启动子区存在一个转录激活区域和一个转录抑制区域,转录因子SMAD4可通过与lncRNA-269启动子区结合显著上调lncRNA-269的启动子活性。

热应激通过钙信号调控湖羊卵巢颗粒细胞凋亡和雌激素合成

热应激严重影响动物的繁殖性能,但热应激是如何通过调控绵羊卵巢颗粒细胞功能进而调控绵羊繁殖的相关研究较少。本研究以湖羊卵巢颗粒细胞为研究对象,利用Real-time PCR、流式细胞技术、Western blot、ELISA等方法探讨热应激对湖羊卵巢颗粒细胞钙信号通路、细胞凋亡和雌激素合成的影响。结果表明,热应激后,湖羊卵巢颗粒细胞中钙离子浓度显著上升(P<0.05),钙离子信号通路中相关基因CACNA1B、CACNA1C、RYR1、CAMK2表达量显著升高,线粒体分裂蛋白FIS1表达量显著上升,促凋亡蛋白家族代表基因BAX和抗凋亡蛋白代表基因BCL2 mRNA表达量比值(BAX/BCL2)显著上升,细胞凋亡率增加;雌二醇合成关键酶CYP19A1表达量显著下调,雌二醇含量显著下降(P<0.05)。热应激卵巢颗粒细胞中加入钙离子螯合剂(BAPTA-AM)明显降低钙离子浓度,同时减少细胞凋亡,缓解热应激造成的卵巢颗粒细胞雌二醇含量下调。综上表明,热应激打开了湖羊卵巢颗粒细胞膜电压门控钙离子通道和内质网膜上钙离子释放通道,导致细胞质中钙离子浓度上升,促进卵巢颗粒细胞凋亡,引起雌二醇含量下调。

湖羊SREBP1基因编码区序列克隆及表达分析

SREBP1是一个重要的核转录因子,参与调控胆固醇和脂肪酸等合成和代谢,本研究旨在基于获得湖羊SREBP1基因序列并分析其组织表达谱和卵巢中的表达定位,了解其在湖羊中可能的生物学功能。本研究利用RT-PCR技术对周岁湖羊卵巢组织中SREBP1基因编码区序列进行克隆和测序,用生物信息学软件对序列进行拼接、同源比对和功能预测分析,荧光定量PCR检测其在湖羊组织中的表达模式,免疫组织化学染色法鉴定其在卵巢组织中的定位。结果显示:SREBP1基因在湖羊卵巢组织中有2种剪接体,对应编码区长度分别为3369 bp和3441 bp,分别编码1122个和1146个氨基酸残基;SREBP1在哺乳动物中相对保守,含有经典的bHLH-Zip结构域,通过识别E-boxes或者固醇调节元件调控靶基因的表达;组织表达谱分析结果显示,SREBP1在湖羊组织中广泛表达,提示SREBP1基因可能参与调控湖羊多种生物学过程。免疫组织化学染色法分析结果显示,SREBP1基因在湖羊卵巢腔前卵泡和有腔卵泡中均有表达,主要定位于颗粒细胞、卵泡膜细胞和黄体细胞中,推测SREBP1可能在湖羊繁殖调控中发挥重要的作用。这些结果为进一步研究湖羊SREBP1基因的功能提供了基础。