猪急性腹泻综合征冠状病毒的流行、致病机制及防控研究进展

目前发现的猪肠道冠状病毒主要有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪三角冠状病毒(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)4种。其中SADS-CoV是2017年首次在我国广东省发现的一种猪肠道冠状病毒,该病毒感染后可致小于5日龄仔猪出现严重急性腹泻、急性呕吐、脱水等症状,死亡率较高,给养猪业造成巨大的经济损失。目前还未见针对SADS-CoV的有效药物和疫苗产品上市,从病毒传播、致病机制、诊断及预防控制等方面综述SADS-CoV的研究进展,期望为SADS-CoV的防控提供参考。

副猪嗜血杆菌致病性及免疫逃避机制研究进展

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)是猪格拉泽氏病(Glasser’s disease)的病原,感染可致猪浆液纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎等病症。Hps血清型众多,不同菌株之间存在抗原异质性和致病力差异。Hps感染致病过程涉及多种毒力因子,如生物被膜、脂寡糖、荚膜、菌毛等结构物质,以及细胞致死膨胀毒素、神经酰胺酶和α-2,3-唾液酸转移酶、外膜蛋白等功能物质。多种毒力因子参与Hps对宿主细胞的黏附、入侵、定植,进而引起炎症反应,包括穿越血脑屏障引起脑炎,最终对宿主细胞和组织器官造成损伤。Hps具有多种复杂的免疫逃避机制,如突破上皮细胞屏障、降解黏膜表面sIgA、抵抗巨噬细胞吞噬和补体的杀伤作用等,从而帮助其抵御宿主免疫系统的杀伤。笔者综述了Hps不同类型毒力因子及其在致病过程中的作用,总结了Hps的免疫逃避机制研究进展,以期为该病的有效防控及新型疫苗研发提供相关新信息。

江浙皖部分地区副鸡禽杆菌分离鉴定及生物学特性研究

为了解江浙皖地区鸡传染性鼻炎流行状况,对浙江、江苏和安徽部分地区疑似鸡传染性鼻炎的8个鸡场进行样品采集,对122份样品进行病原菌分离,对10株分离株进行形态学、卫星试验、PCR鉴定、生化鉴定和血清型鉴定等检测;利用分离株人工感染SPF鸡的动物回归试验,对攻毒后7 d和14 d的鸡只进行病理剖检和病理组织切片观察。结果表明,122份样品中副鸡禽杆菌阳性数为48个,阳性率为39.3%,8个养殖场的阳性率为36.8%~50.0%。10株副鸡禽杆菌分离菌,其中A型3株、B型4株、C型3株,致病率为60%~80%。表明不同血清型副鸡禽杆菌在江浙皖地区均有流行,具有一定的致病性,这为鸡传染性鼻炎三价疫苗研发和防控提供参考。

基于生物反应器的猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)悬浮培养工艺研究

为了优化生物反应器全悬浮培养技术制备猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的工艺,试验首先通过摇瓶培养对病毒接种时的细胞密度、胰酶浓度、接毒剂量和收毒时间等培养条件进行优化;之后按照摇瓶培养确认的工艺进行生物反应器全悬浮培养工艺验证,同时对pH值、溶氧值(DO)、转速等培养参数进行优化,以病毒含量(TCID_(50))为指标,最终筛选出在15L生物反应器中培养猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的最优条件,并进一步在50L生物反应器中进行工艺验证,将病毒液灭活后稀释至1×10^(7).0TCID_(50)/mL免疫怀孕75~90d的健康易感初怀母猪,在分娩当日,采集母猪和仔猪血清,并对分娩的3日龄仔猪攻毒进行免疫原性试验。结果表明:猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)在摇瓶上的最适培养条件为当细胞密度达到6×10^(6)个/mL以上时,用含胰酶(终浓度为20μg/mL)的无血清培养基将细胞密度稀释至2×10^(6)个/mL,按感染复数(MOI)=0.1接毒,130 r/min摇床振荡培养36h可收获病毒液,病毒含量可稳定达到1×10^(7.5)TCID_(50)/mL以上;猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)在15L生物反应器上的最适培养条件为pH值7.0~7.2、DO值50%、转速80~100 r/min,培养36h收获的病毒液含量可稳定在1×10^(7.5)TCID_(50)/mL以上;在50L生物反应器上放大培养收获的病毒液含量为1×10^(7).8TCID_(50)/mL。母猪和仔猪中和抗体效价均≥1∶32,免疫保护力为100%。说明本试验条件下成功建立并优化了生物反应器全悬浮培养制备猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的工艺,生产的猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的免疫原性较好。

β-巯基乙醇对牛孤雌胚胎发育的影响

【目的】研究β-巯基乙醇（β-ME）对牛卵母细胞核成熟和孤雌胚胎发育的影响。【方法】向OMM和SOF中添加0，0．05，0．10和0．15mmol／L β-ME，并在牛卵母细胞激活后，分别于1-细胞期、8～16细胞期、桑葚胚期向SOF中添加0．1mmol／L β-ME，通过比较胚胎体外发育水平确定添加β-ME的最佳时期。【结果】β-ME对牛卵母细胞核成熟无显著影响（P〉0．05）；0．05和0．10mmol／L β-ME均可显著提高牛孤雌胚胎的卵裂率及囊胚发育水平，但以0．10mmol／Lβ-ME添加组的效果较佳；牛孤雌胚胎发育到1-细胞期和8～16细胞期前，添加0．10mmol／L的β-ME，均可显著提高囊胚的发育水平（P〈0．05），但1-细胞期添加β-ME时的囊胚率、囊胚细胞数显著高于8～16细胞期组（P〈0．05），故1-细胞期是添加β-ME的最佳时机。【结论】β-ME对牛卵母细胞核成熟无促进作用，但可提高牛孤雌胚胎的卵裂率并促使囊胚发育，且在8～16细胞期前添加β-ME均可提高囊胚发育水平，但以1-细胞添加0．10mmol／Lβ-ME的促进效果最佳。

动物乳腺生物反应器研究进展

针对利用动物乳腺生物反应器技术生产重组蛋白,具有生产效率高和经济效益明显的特点。综述了制备乳腺生物反应器时表达载体构建和基因转移两个关键环节的研究现状,并就基因打靶和体细胞克隆技术的结合探讨了乳腺生物反应器的发展趋势。

卵泡生长发育及其调控的研究进展

综述了卵泡生长发育的动态模式,即卵泡经原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦腔卵泡发育至排卵卵泡的过程,着重阐述了卵泡生长发育过程中的调控机制,为进一步研究卵泡的生长、发育和排卵机制提供了理论基础。

高效抗逆转录病毒疗法引起神经炎症的研究进展

高效抗逆转录病毒疗法是一种可以有效治疗人类免疫缺陷病毒感染的组合疗法,但是会引起诸多不良反应,其中包括神经炎症。神经炎症是一种发生在神经系统中的炎症反应,会影响人类免疫缺陷病毒感染患者的预后效果。文章简单介绍了高效抗逆转录病毒疗法的应用近况和不良反应,如肝损害、高血脂、线粒体毒性等。着重介绍了高效抗逆转录病毒疗法导致神经炎症的相关研究。还介绍了神经炎症的发生机制和危害,包括创伤、感染和神经退行性疾病。阐述了高效抗逆转录病毒疗法引起神经炎症的可能机制,指出利用高效抗逆转录病毒疗法治疗人类免疫缺陷病毒感染的意义。

家蚕具有CHCH结构域的蛋白家族基因BmCH的原核表达和亚细胞定位

含有CHCH保守结构域的蛋白在不同物种中行使不同的功能。从家蚕蛹cDNA文库筛选获得一条cDNA序列,经生物信息学分析发现其编码蛋白含有一个CHCH保守结构域,将该基因命名为BmCH(GenBank登录号:DQ443425.1)。该序列开放阅读框大小为435 bp,编码144个氨基酸残基。将成功构建的重组质粒pET-28a(+)-BmCH转化到E.coli Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达BmCH融合蛋白,用亲和层析进行纯化后,将融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。通过Westernblotting检测BmCH在家蚕4个发育时期和5龄幼虫组织中的表达情况与用荧光定量PCR检测BmCH在家蚕不同发育时期及5龄幼虫组织中的转录结果基本一致:该蛋白在卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,其中在5龄幼虫期的表达量最高;该蛋白在5龄幼虫的表皮、精巢、中肠、丝腺和卵巢中有明显表达,在血淋巴、马氏管、脂肪体中的表达量较少,但差异不大,而在气管和头部没有表达。利用抗体的免疫荧光标记对BmCH在家蚕BmN细胞中的定位进行研究,观察到该蛋白主要分布在细胞质中。初步推测BmCH可能是家蚕生长发育的必需蛋白,参与多种细胞生命活动的过程。

人乳腺组织中乳铁蛋白基因cDNA的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术从人乳腺癌组织中扩增出长度为2259 bp的人乳铁蛋白cDNA,PCR产物经凝胶回收纯化后,克隆在pMD 18-T载体的T位点。测序结果和序列分析显示,与GenBank中收录的人、小鼠、奶牛和山羊的乳铁蛋白cDNA序列的同源性分别为99．73％,82．19％,81．79％和87．28％。其中与人乳铁蛋白cDNA 序列相比,发现有5个碱基因等位基因间的突变而发生变异,1个碱基发生了未知的突变,表明已成功的扩增、克隆了人乳铁蛋白基因cDNA序列,此基因序列的GenBank登录号为AY165046。

山羊胎儿成纤维细胞的冷冻保存和体外培养(英文)

将胎儿成纤维细胞悬浮于不同的冷冻保护液中 ,在不同的温度下进行冷冻保存试验。结果显示 ,当保护液中含有 90 0 m L / L胎牛血清 (FBS)时 ,- 196℃下保存的山羊胎儿成纤维细胞解冻后的细胞贴壁率高于- 80℃ ,且前者贴壁细胞增殖也较后者快 ,二者间差异显著 ;而在 - 2 0℃条件下只有一小部分细胞能够存活 ,与前两者相比差异极显著 ,说明 - 2 0℃不适合冷冻胎儿细胞。冷冻保护液中含有 10 0 m L / L二甲基亚砜 (DMSO)的保护效果明显好于 5 0 m L / L DMSO,二者间差异显著。用组织块法培养的细胞 ,在两种培养基 DMEM和 M199中添加 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 -巯基乙醇 (2 - Me) ,其组织块成活率及细胞生长速度均高于单纯添加 10 0 m L / LFBS,同时证明 DMEM和 M199都能用于胎儿成纤维细胞的体外培养。以 DMEM培养液为基础 ,分别添加 2mm ol/ L 2 - Me,5 m L / L FBS,10 0 m L / L FBS和 2 m mol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS对山羊胎儿成纤维细胞进行体外培养 ,结果显示 ,细胞在 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS培养液中生长迅速 ,两者间无明显差异 ,2 - Me的存在促进了细胞的增殖 ;两者都与添加 2 m mol/ L 2 - Me组存在显著差异 ;添加 2 m mol/ L 2 - Me和 5m L / L

基于校企合作模式的生物技术专业实践教学改革探讨

校企合作教学作为一种以实践为导向的教学模式,是培养大学生专业素质、实践技能、创新意识和提升大学生职业竞争力的有效途径。作者介绍了校企合作教学模式及其在高校生物技术专业人才培养中的重要作用,结合所在高校生物技术专业对校企合作教学模式的探索实践,对校企合作教学模式的有效途径和方法进行了分析,为高等院校生物技术专业开展实践教学改革提供新思路。

人类人工染色体(HACs)研究进展

人类人工染色体(HACs)由着丝粒、端粒和复制起点组成。通过对天然染色体的改造或者从头构建的方法可以获得多种类型HACs。HACs可以携带大片段基因组DNA,是建立转基因动物模型的重要手段,在基因治疗方面也有着广阔的应用前景。文章从HACs的结构及各组成元件的功能、HACs的不同构建方法、HACs在转基因研究及基因治疗中的应用等方面,对HACs的最新研究进展进行了综述,同时指出了HACs研究中存在的问题,并对HACs的应用前景进行了展望。

PBL结合传统讲授法在“动物生物学”教学中的应用效果评价

探讨基于问题学习PBL结合传统讲授法LBL在普通本科院校"动物生物学"教学中的应用效果。PBL结合LBL的班级作为实验班,单纯采用LBL的班级为对照班,对两个班级的期末试卷及相应采用PBL 4章节的成绩进行比较,同时以问卷调查方式考查受试学生对PBL教学方法的评价。结果表明:实验班无论是在试卷平均成绩还是在4章节的平均成绩上均高于对照班,差异有统计学意义(P<0.05);问卷调查结果也显示学生普遍认可PBL教学方法。PBL结合LBL在"动物生物学"教学中应用效果良好,能明显提高该学科的教学质量。

绵羊肌肉抑制素C-端的表达、纯化及多克隆抗体的制备

为深入了解绵羊myostatin基因的表达及调控机理,进行了绵羊myostatin蛋白多克隆抗体的制备。首先将绵羊myostatin基因C-端克隆入含组氨酸标签的表达载体pET-30a-c(+)中,转化大肠杆菌BL21后IPTG诱导表达,然后利用Ni2+亲和层析纯化重组蛋白,薄层扫描及Bradford法分别检测纯化后蛋白的纯度与含量。应用重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法检测多克隆抗体效价,用Western blot及免疫细胞化学染色检测抗体特异性。结果,薄层扫描分析纯化后蛋白纯度可达95%以上,Bradford法检测蛋白浓度约5 mg.mL-1,制备的抗血清效价可达1∶250 000以上,Western blot检测证明抗体特异性良好,免疫细胞化学染色表明抗血清可检测到肌肉细胞中内源性myostatin的表达,说明所制备的多克隆抗体可以应用于进一步研究,有助于阐明绵羊myostatin的表达及调控机理。

血清、促性腺素、EGF和水对山羊卵母细胞体外成熟的影响(英文)

为了通过比较培养筛选出能改进和提高山羊卵母细胞体外成熟效率的培养体系 ,培养的山羊卵母细胞以 TCM-199为基础培养液 ,添加 :(1) 10 %血清 (胎牛血清 (FBS)或发情山羊血清 (EGS) ) +2 0 m g/ L促黄体素 (L H) +10 mg/ L促卵泡素 (FSH) +1m g/ L 雌二醇 (E2 ) ;(2 ) 10 % EGS+促性腺素 (L H∶ FSH=5 mg/ L∶ 0 .5 m g/ L 或 2 0 mg/ L∶ 10mg/ L )或者 0 .0 75 IU / m L人绝经期促性腺素 (HMG) +1mg/ L estradiol 17β;(3) 10 % EGS+0 .0 75 mg/ L HMG+10～ 2 0 μg/ L EGF。此外 ,以 M199+10 % EGS+0 .0 75 mg/ L HMG+10～ 2 0 μg/ L EGF为培养基 ,溶解于自制超纯水或储存的商品化超纯水来培养卵母细胞。培养条件为 38℃ ,5 % CO2 。培养 2 4 h后 ,在体式显微镜下统计处于 M 期的卵母细胞比例。结果显示 :在卵母细胞成熟液中添加 10 % EGS比 10 % FBS的成熟培养效果好 ;添加 HMG能够促进卵母细胞的成熟 ,其效果比添加不同比例的 L H/ FSH好 ;成熟液中添加 10～ 2 0μg/ L EGF能促进卵母细胞的成熟 ,但成熟率没有明显提高 ;新鲜的超纯水对于卵母细胞的培养是必要的。结论 :新鲜超纯水配制的 M199+10 % EGS+0 .0 75 IU / m L HMG+10～ 2 0μg/ L

供体细胞来源及预处理对牛体细胞核移植效率的影响

以牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体细胞,比较了不同同步化诱导方式(血清饥饿法与接触抑制法)、供体细胞冷冻与否、供体动物性别与年龄等因素对体细胞核移植效率的影响。结果表明,接触抑制法处理的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于饥饿法(P<0.05);未冷冻的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于冷冻供体细胞(P<0.05);成年母牛供体的囊胚率显著高于成年公牛(P<0.05);不同年龄供体细胞的核移植胚囊胚率差异不显著(P>0.05)。试验表明,以接触抑制法诱导未冷冻成年母牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体,有利于核移植胚囊胚的发育。

Bm59基因缺失对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制、转录及组装的影响

Bm59是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)的核心基因之一。利用λRed重组技术和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒wt Bacmid-polh-egfp、缺失型病毒Bm59ko-Bacmid-polh-egfp以及补回型病毒Bm59re-Bacmidpolh-egfp,并分别转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,研究Bm59基因在病毒侵染、增殖和组装中的功能。对病毒滴度的检测结果表明3种类型病毒都能产生有活力的子代病毒并使细胞感染发病,但Bm59ko-Bacmid-polh-egfp在各个时相的滴度值均显著低于其他2种类型病毒(P<0.05)。电子显微镜下观察Bm59ko-Bacmid-polh-egfp转染的细胞中只有少量细长的杆状病毒粒子,而其他2种类型病毒转染细胞后则能产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子。qRT-PCR检测结果显示,Bm59缺失型病毒基因组DNA的复制能力显著降低(P<0.05),早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平显著低于野生型病毒(P<0.05)。综上所述,Bm59基因虽然是家蚕核型多角体病毒复制的非必需基因,但会显著影响病毒的增殖速度和病毒粒子的组装,对病毒各个时期的基因转录水平具有下调作用。

牛乳腺核基质附着区的克隆及其功能研究

从奶牛的全血中提取基因组DNA,参照GenBank已有序列,通过Prim er5.0和Vector 7.0辅助设计一对引物,克隆了牛乳腺核基质附着区(BMR s)。利用生物学软件对其进行初步分析后,TA克隆于pMD 18-T vector上。上下游引物5′端分别引入Kpn2Ⅰ和XhoⅠ酶切位点,将所得的BMR s克隆到pEGFP-C1的报告基因下游,构建成表达载体pBE,脂质体法转染牛耳成纤维细胞。以转染pEGFP-C1的牛耳成纤维细胞作为对照,发现所克隆的BMR s功能明显,在消除位置效应、增强报告基因表达方面具有一定的作用。

猪流行性腹泻病毒S1-NTD蛋白表达及其免疫原性研究

[目的]在昆虫细胞中表达猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1 NTD蛋白,研究其免疫原性,为基于PEDV S蛋白的基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础.[方法]PCR扩增PEDV S1-NTD基因,构建其重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD和重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD.将Ac-PEDV S1-NTD转染sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD.将P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,Western blot鉴定重组蛋白的表达,空斑试验测定重组杆状病毒的滴度.在此基础上,分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.1,1和3的P2代重组杆状病毒感染sf9细胞,并在感染后1,2,3,4和5d收集细胞,通过Western blot和空斑试验分别检测目的蛋白的表达量和重组杆状病毒的增殖情况.将MOI为0.1的P3代重组杆状病毒皮下注射免疫BALB/c小鼠,每隔2周免疫1次,共免疫3次,以注射PBS、空载体Bacmid和PEDV商业疫苗为对照组,于首免后不同时间采集血液分离其血清,ELISA法检测血清中PEDV特异性抗体的水平;于首免后35 d剖取小鼠脾脏,分离其淋巴细胞;PEDV刺激后,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖情况.[结果]PCR扩增获得了约738 bp的PEDV S1-NTD基因;成功构建了重组表达质粒pFastBac Dual PEDV S1-NTD、重组穿梭质粒Ac-PEDV S1-NTD和重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD.利用杆状病毒表达系统在sf9细胞内成功表达了重组PEDVS1-NTD蛋白,且杆状病毒以MOI为1感染sf 9细胞后在第3天蛋白表达量达到最高.在首免后35 d,重组杆状病毒免疫组小鼠血清效价达到最高值,为1∶5 000,与商业疫苗组效价一致;淋巴细胞增殖试验表明,重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD免疫组小鼠脾淋巴细胞对PEDV的刺激也发生了显著增殖(P<0.05),而PBS和空载体Bacmid对照组淋巴细胞未发生明显增殖(P>0.05).[结论]成功构建了重组杆状病毒rvAcPEDV S1-NTD,在昆虫细胞中成功表达了PEDV S1-NTD蛋白,且具有较好的免疫原性.