三角褐指藻dxs基因克隆与诱导表达

为研究6种外源因素处理对三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因表达的影响,通过高通量转录组测序技术获得三角褐指藻dxs基因cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析。研究结果表明,三角褐指藻dxs基因cDNA全长2476 bp,ORF全长2193 bp,编码730个氨基酸,具有高度保守的ThDP结合位点和转酮醇酶结构域。三角褐指藻DXS蛋白为亲水性稳定蛋白,相对分子质量(M_(w))为79.31 kD,理论等电点为6.65,具有信号肽、跨膜区域、卷曲螺旋和TM-螺旋等。系统进化树分析结果表明,DXS蛋白进化树分为高等植物和藻类2个分支,高等植物DXS蛋白进一步分为DXS1和DXS2两支,藻类DXS蛋白聚类为3个分支,分别为硅藻门、红藻门和绿藻门分支,三角褐指藻聚类在硅藻门分支上。诱导表达调控结果表明,三角褐指藻dxs基因受到茉莉酸甲酯(MeJA)、花生四烯酸(AA)、硫酸铈铵(ACS)、光合诱导素(PIF)、光合抑制剂(DCMU)和光质等6种外源因素的诱导调控。在100μmol/L MeJA、62.5 mg/L AA、1.6 mg/L ACS、1.00μg/L PIF、0.2 mg/L DCMU和紫光处理下,三角褐指藻dxs基因表达量最高。在MeJA和光质处理下,三角褐指藻dxs基因表达量与岩藻黄素含量变化趋势一致,说明DXS是MeJA和光质等诱导子促进三角褐指藻岩藻黄素积累的关键酶之一。研究为进一步利用代谢工程手段提高藻细胞内岩藻黄素含量提供了良好的基因资源,为深入探索三角褐指藻岩藻黄素合成的分子调控机制提供了一定的理论依据。

三角褐指藻岩藻黄素合成相关的ZEP家族基因的生物信息学、亚细胞定位及表达分析

目的克隆三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)玉米黄质环氧化酶ZEP家族基因,为深入研究其在岩藻黄素合成途径中的功能奠定基础。方法通过转录组测序获得了3条三角褐指藻ZEP家族基因(ZEP1、ZEP2和ZEP3)的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析。构建瞬时表达载体,经农杆菌介导转染烟草,在共聚焦显微镜下观察其亚细胞定位。用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测ZEP家族基因的表达。结果三角褐指藻ZEP1、ZEP2和ZEP3蛋白均属于FAD/NAD(P)-binding domain同源超家族,为亲水酸性蛋白,存在信号肽,其中ZEP1和ZEP3属于跨膜蛋白,ZEP2不属于跨膜蛋白。系统进化树分析结果表明,三角褐指藻与圆柱拟脆杆藻(Fragilariopsis cylindrus)和假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)等硅藻的ZEP蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位结果表明,三角褐指藻ZEP1和ZEP2蛋白定位于叶绿体上,而ZEP3蛋白定位于细胞质上。qRT-PCR结果表明,随着光合诱导素(photosynthetic induction factor,PIF)浓度的增加,3个基因的表达整体呈上升趋势,岩藻黄素的含量逐渐升高。结论ZEP家族基因表达与岩藻黄素含量变化趋势均一致,说明该家族基因的表达可能与岩藻黄素的生物合成存在一定的关系。

三角褐指藻岩藻黄素合成关键酶PtHMGR基因的克隆与诱导表达调控研究

目的研究茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、硫酸铈铵(ammonium cerous sulfate,ACS)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)、光和促进剂(photosynthetic induction factor,PIF)、光合抑制剂[3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea,DCMU]和不同光质对三角褐指藻3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutarate monoacyl-CoA reductase,HMGR)基因PtHMGR表达的影响,研究不同外源因素处理下PtHMGR基因表达与岩藻黄素含量之间的关系。方法通过转录组测序获得PtHMGR基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析,有机溶剂提取法测定MeJA、ACS、AA、PIF、DCMU和不同光质处理下三角褐指藻岩藻黄素含量,荧光定量多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测PtHMGR基因表达。结果PtHMGR基因全长2161 bp,其ORF长1914 bp,编码637个氨基酸。PtHMGR蛋白分别含有2个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP)和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMG-CoA)结合基序,催化结构域包含L-domain、S-domain和N-domain,N端存在3个跨膜螺旋区。系统进化树分析结果表明,动物和植物HMGR明显分为2支,三角褐指藻与假微型海莲藻(Thalassiosira pseudonana)HMGR蛋白的亲缘关系最近,同处于水生植物一支。荧光定量PCR分析结果表明,12.5 mg·L^(-1)AA、0.4 mg·L^(-1)ACS、0.05μg·L^(-1)PIF、0.4 mg·L^(-1)DCMU和紫光处理下PtHMGR基因表达水平最高。相关性分析结果表明,ACS和不同光质处理下岩藻黄素含量与PtHMGR基因表达呈正相关。结论PtHMGR基因是参与ACS和不同光质调控三角褐指藻岩藻黄素合成的关键基因之一,PtHMGR与三角褐指藻岩藻黄素的合成与积累具有密切关系。