黑曲霉F044脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究

黑曲霉F044脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析得到电泳纯的脂肪酶，纯化倍数为73．71倍，活性回收率为34％。对纯化脂肪酶性质研究表明：该脂肪酶分子量约为35～40kD，水解橄榄油的最适温度和最适pH分别为45℃和7．0，在60℃以下和pH2．0～9．0之间有很好的稳定性。该脂肪酶的水解活性对Ca^2＋表现明显的依赖性，而Mn^2＋、Fe^2＋和Zn^2＋对脂肪酶则有显著的抑制作用。在最适条件下水解pNPP的Km和Vmax分别为7．37mmol／L和25．91μmol／（min·mg）。其N-端的15个氨基酸序列为Ser（Glu／His）-Val-Ser-Thr-Ser-Thr-Leu-Asp-Glu-Leu-Gln-Leu-Phe-Ala-Gln。

黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列,运用生物信息学方法,找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689.根据该基因序列,设计引物直接经RT-PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl.anl全长1 044bp,含3个内含子,编码297个氨基酸(含信号肽27个氨基酸),与其他脂肪酶基因没有明显的同源性.将成熟脂肪酶基因连接到pPIC9K载体上得到重组表达质粒,转化P.pastorisGS115.脂肪酶基因在P.pastorisGS115中实现了分泌性表达.

生物柴油生产用脂肪酶资源及研发现状

归纳分析了目前生物柴油酶法生产工艺中使用的脂肪酶种类、国内外产品市场供求情况,并重点介绍了南极假丝酵母脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶以及米根霉脂肪酶的研发现状。

黑曲霉脂肪酶:基因克隆、表达及体外复性

根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列,运用生物信息学方法,找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689。根据该基因序列,设计引物直接PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl。anl全长1044bp,含3个内含子,编码297个氨基酸(含信号肽27个氨基酸),与其它脂肪酶基因没有明显同源性。将编码成熟脂肪酶的anl连接到pET28a载体上得到重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(De3),诱导表达并纯化出目的蛋白。通过大量稀释和DEAESepharoseFastFlow层析相结合的方法,变性后的纯化蛋白在体外实现再折叠复性。

提高微生物脂肪酶产量、活性和稳定性的方法研究

微生物脂肪酶是一类广泛应用于诸多工业领域的生物催化剂。提高微生物脂肪酶的产量、活性和稳定性,增强产品的市场竞争力,一直是微生物脂肪酶研究的重点和热点。本文从产脂肪酶菌株的改造、脂肪酶基因的改良、脂肪酶发酵工程和脂肪酶后期处理等四个方面概述了提高微生物脂肪酶产量、活性和稳定性的方法,以期为微生物脂肪酶的规模化工业生产提供方法性指导。

微生物脂肪酶活性构像的形成及激活过程中的影响因子

微生物脂肪酶是一类具有重要应用价值的生物催化剂。作为一种胞外酶,其活性构像的形成及激活是一个高度复杂而特异性的生理过程。综述了作为微生物脂肪酶的结构成分,参与脂肪酶折叠和激活过程中的各种因子及其作用机制,这些因子包括脂肪酶特异性的折叠酶、脂肪酶激活因子、前序列、钙离子和二硫键等。

黑曲霉脂肪酶分子结构预测

根据克隆到的黑曲霉脂肪酶基因序列,概念性翻译出其编码的氨基酸序列。利用BioEdit、PSIPRED和Swiss-Model等软件及服务器对黑曲霉脂肪酶的一级结构、二级结构和三级结构进行分子结构模型的预测与模拟。预测结果显示,黑曲霉脂肪酶分子的一级结构、二级结构及三级结构的结构特点与丝氨酸水解酶高度吻合。预测的黑曲霉脂肪酶各种二级结构成分含量与实际测定的重组黑曲霉脂肪酶二级结构成分相符。在三级结构水平上,黑曲霉脂肪酶"盖子"结构域所在的位置与已解析的黑曲霉阿魏酸酯酶对应结构域所在的位置存在显著差异。盖子结构域位置的差异预示一种开盖型脂肪酶分子设计和构建的可能。

海洋破囊壶菌Thraustochytrium sp．FJN-10 DHA生物合成途径相关延长酶的克隆与表达

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是具有各种重要生理功能的高度不饱和脂肪酸。以海洋真菌Thraustochytrium sp.FJN-10为研究对象,利用RT-PCR结合RACE,获得了两个碳链延长酶(TFD6和TFD5)的完整基因,其中TFD6 cDNA全长816 bp,编码271个氨基酸;TFD5 cDNA全长831 bp,编码276个氨基酸。将TFD6、TFD5酶切后分别连接到HindⅢ/XbaⅠ处理过的pYES2载体,醋酸锂法转化酿酒酵母感受态细胞,成功构建了延长酶酵母表达系统。气相色谱分析表明TFD6可延长C18:3n-6至C20:3n-6,TFD5可延长C20:5n-3至C22:5n-3。

细菌脂肪酶的结构和功能研究进展

细菌脂肪酶是一类广泛应用于工业领域的生物催化剂,具有重要的应用价值。迄今为止,已有7个细菌脂肪酶的三维结构被阐明,30个细菌脂肪酶的基因序列被测定和分析。作者综述了细菌脂肪酶的分子结构、分泌和折叠过程及其催化机制。

破囊壶菌Δ~4-脂肪酸脱饱和酶基因5'端侧翼区域的克隆与鉴定

应用衔接头PCR(LA-PCR)技术,扩增得到约1000 bp的海洋破囊壶菌Δ4-脱饱和酶基因5’端侧翼区域的单一产物.对该产物测序,经启动子软件与序列比对分析,发现该序列(Genkbank登录号EU074209)具有真核启动子序列的基本结构特征,含有TATA盒、CAAT盒、INR等元件.将扩增得到的脱饱和酶基因5’端侧翼序列亚克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的质粒pGlow-TOPO中,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌细胞.荧光显微观察大肠杆菌阳性转化子发出荧光,侧翼序列含有启动子功能得到确认.

酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅰ基因的超表达

利用重叠延伸PCR融合磷酸甘油激酶(phosphoglycerate kinase,PGK)启动子和酿酒酵母乙醇脱氢酶基因Ⅰ(alcohol dehydrogenaseⅠ,adh1),将该融合片段插入带有G418抗性基因(KanMX)和loxP位点的pUG6质粒中,并在adh1基因下游插入细胞色素c(Cytochrome c transcription,CYC1)终止子,构建了酿酒酵母整合表达载体pUPGKAT。TthⅢⅠ内切酶线性化后转化酿酒酵母乙醇脱氢酶基因Ⅱ(adh2)敲除菌株YS2-△adh2。根据酿酒酵母同源重组机制,使adh1基因增加1个拷贝,且其中1个拷贝置于PGK强启动子下游,利用PGK启动子的调控成功实现adh1基因的超表达。厌氧发酵试验表明该重组菌株YS2-△adh2-adh1的乙醇产量较出发菌株提高了8.84%。

裂殖壶菌EST文库cdc2基因的筛选与分析

利用已建立的裂殖壹菌(Schizochytrium sp FJU-512)EST文库,通过序列比对分析发现p34cdc2相似基因的3′端序列,分离含该EST序列的质粒ROCHA2004,以T7引物进行反向测序,获得p34cdc2相似基因的全长序列,结合NCBI的ORF finder以及Blastx程序获得p34cdc2蛋白的氨基酸序列;利用同源模建方法构建了该蛋白的三维空间结构,并预测其功能结构域;对该蛋白进行系统发育分析,构建进化树,结果显示该蛋白同小麦(Triticum aestivum)的p34cdc2序列亲缘关系最近。

代谢工程在酿酒酵母茵育种中的应用研究进展

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是传统的乙醇生产重要菌株,也是第1个完成基因组测序的真核生物。随着世界能源储备的日益枯竭,燃料乙醇作为液体可再生能源的广泛应用,利用生物技术对酿酒酵母进行遗传修饰,改变其代谢网络,构建高产乙醇的转基因酿酒酵母已成为当今酿酒酵母分子育种的热点。针对近年来利用代谢工程拓展酿酒酵母底物利用范围、降低副产物生成率、提高乙醇产量、改良细胞特性以及缩短发酵周期等方面的研究进展予以综述。

线虫生防细菌W3对线虫侵染活性的测定

目的:筛选以体壁穿透方式进入线虫体内而引起宿主致病的杀线虫细菌,为开发新的植物寄生线虫生防战略奠定基础。方法:通过毒性测试和平板法筛选杀线虫细菌,利用显微镜和扫描电镜研究观察细菌对线虫的作用方式和侵染过程。结果:筛选获得的杀线虫细菌菌株W3具有明显的侵染活性。生测结果表明,细菌培养上清液和上清蛋白粗提物对腐生线虫致死率分别达到95%和100%。在平板测试中,测试线虫体壁被严重破坏,在48h内超过80%的线虫被杀死和降解。扫描电镜观察可以明显的看到细菌穿透线虫体壁后在线虫体壁上留下的孔。结论:细菌W3具有显著的杀线虫活性和线虫体壁降解活性,其杀线虫活性物质主要存在于细菌培养上清液中。

裂殖壶菌酰基载体蛋白(ACP)基因的克隆与表达

ACP(Acyl carrier protein,酰基载体蛋白)参与高度不饱和脂肪酸的PKS(Polyketide synthase)生物合成途径。从Schizochytrium sp.FJU-512 cDNA文库中获得了ACP基因的cDNA克隆。该序列开放读码框全长429bp,编码142个氨基酸,等电点为5.04,具有4′-磷酸泛酰巯基乙胺(4′-PP)的结合位点。利用BamHⅠ/HindⅢ双酶切,并连接到原核表达载体pET-30a,构建了pET-30a/acp表达载体,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表明该蛋白得到高效表达。

黑曲霉脂肪酶盖子结构域突变对其活性的影响

比较黑曲霉脂肪酶与黑曲霉酯酶的3-D结构发现二者在盖子结构域存在显著差异。根据已解析的酯酶的3-D结构信息,运用重叠延伸PCR技术,对黑曲霉脂肪酶的4个位点进行突变,以期获得开盖型黑曲霉脂肪酶。4个突变位点分别为形成黑曲霉脂肪酶盖子结构的α-螺旋与酯酶对应区域的α-螺旋相互置换;Ser84突变为Gly;Asp99突变为Pro;Lys108突变为Glu。4个重组质粒导入毕赤酵母GS115菌株进行异源表达后,仅pPCI9K-anl-D99P和pPCI9K-anl-K108E实现了活性表达。

环孢菌素A产生菌的分子鉴定及其原生质体制备

环孢菌素A高产菌株No.421502经形态学特征和分子标记鉴定,确认为镰孢菌属,命名为Fusariumsp.No.421502.收集Fusarium sp.No.421502孢子刚萌发的幼嫩菌丝体,以0.7 mol/L KCl为渗透压稳定剂,用质量浓度为20 mg/mL的蜗牛酶,30℃80 r/min处理5 h制备原生质体.原生质体为7×105/mL,原生质体形成率为62.8%.制备的原生质体稀释后接入再生培养基,再生率为29.6%.

细菌脂肪酶在大肠杆菌细胞表面的功能性展示

细胞表面展示技术已广泛应用于突变文库的高通量筛选,有力地促进了蛋白质工程的发展。以来自于铜绿假单胞菌的自转运蛋白Est A的羧基端结构域作为锚定区,构建脂肪酶LipA与EstA羧基端结构域的融合基因,并将融合基因插入到改造后的pACYC-Duet表达载体中,获得表面展示载体pBCCB-X1。将载体pBCCB-X1分别导入到大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600菌株中,以IPTG诱导融合基因的表达。分别用三丁酸甘油酯定性检测和pNPO定量检测诱导表达后的全细胞脂肪酶的水解活性。试验结果表明,脂肪酶LipA在大肠杆菌JK321和大肠杆菌UT5600细胞表面均得到功能性展示,水解活性分别为(2.8±0.1)U/OD和(2.6±0.06)U/OD。脂肪酶LipA在大肠杆菌细胞表面的功能性展示,为后续高通量筛选LipA突变基因文库,奠定了坚实的基础。

Burkholderia sp.ZYB002中lipA基因的敲除对细胞脂肪酶活性的影响

Burkholderia sp.ZYB002菌株不仅能产生大量的胞外脂肪酶,还能产生大量的细胞结合脂肪酶。对细胞结合脂肪酶的种类进行定性研究,将为开发全细胞脂肪酶催化剂奠定基础。通过分析与Burkholderia sp.ZYB002菌株具有较高同源性的Burkholderia cepacia J2315菌株的脂肪酶基因家族,推测潜在的细胞结合脂肪酶编码基因。通过同源重组插入失活Burkholderia sp.ZYB002菌株的lipA基因,筛选出突变体转化子;测定突变体菌株细胞结合脂肪酶的活性,并与野生型菌株比较。试验结果表明,lipA基因插入失活的Burkholderia sp.ZYB002-ΔlipA菌株的细胞结合脂肪酶活性降低了42%。

响应面法优化有机溶剂极端耐受性菌株 Burkholderia sp.ZYB002产脂肪酶条件

Burkholderia sp.脂肪酶具有较高的有机溶剂耐受性和转酯活性,广泛应用于手性化合物的拆分。本研究利用统计学方法对一株具有有机溶剂极端耐受性的脂肪酶高产菌株Burkholderia sp.ZYB002在摇瓶培养条件下产脂肪酶条件进行了优化。通过单因素实验,首先确定了最适碳源、氮源、诱导剂等。以Plackett-Burrman设计筛选影响Burkholderia sp.ZYB002产酶的主要因素,通过最陡爬坡实验和响应面分析法确定产酶最适条件。K_2HPO_4、大豆油乳化液和起始pH确定为影响菌株产酶的3个主效因素。最佳产酶条件为:糊精0.3%(W/V),牛肉膏2.0%(W/V),MgSO_4.7H_2O 0.075%(W/V),K_2HPO_40.14%(W/V),大豆油乳化液4.89%(V/V),pH 8.11,玻璃珠10颗/瓶,接种量2.0%(V/V),30℃,250r/min,发酵时间22h。在此条件下,发酵液脂肪酶酶活最高达45.6U/mL,较发酵基本培养基发酵液的脂肪酶酶活提高了3.44倍。