巨魾线粒体12S rRNA和16S rRNA基因克隆及多态性分析

运用酚-氯仿方法提取12尾采集于云南省境内河口县的巨魾DNA,利用GenBank中鮡科种类设计特异性引物进行PCR扩增和克隆,利用DNAMAN软件进行序列比对以及采用软件MEGA 4.0来分析巨魾的碱基含量、遗传距离和系统进化树.结果显示:(1)得到954bp的12S rRNA基因序列和535bp的16S rRNA基因序列各12条;(2)12尾巨魾的12S rRNA基因、16S rRNA基因以及12S rRNA基因和16S rRNA的合并基因序列的相似性分别为99.89%,99.95%,99.89%;(3)12尾巨魾的12S rRNA,16S rRNA均表现出A+T碱基含量高于G+C碱基含量;(4)12尾巨魾的平均遗传距离为0.002,转换比颠换的平均值为3.065;(5)利用Neighbor-Joining(NJ)法构建的系统进化树表明魾属单独成一支,支持率达到99%,这一结果与传统的形态学分类基本相似.

九孔鲍MSTN基因cSNP多态性及与生长性状关联分析

九孔鲍(Haliotisdiversicolorsupertexta)是中国南方具有较高经济价值的养殖贝类。肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)是转化生长因子β超家族(TGF-β)中参与动物肌肉生长的重要调控因子,因此MSTN基因是动物遗传改良的重要候选基因。为探究九孔鲍MSTN基因的多态性及其生长相关性,实验采用PCR产物直接测序方法对九孔鲍MSTN基因进行单核苷酸多态性(SNP)筛选,对MSTN基因SNP与体质量、壳长、壳宽进行关联性分析,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测九孔鲍MSTN基因不同基因型的表达水平。结果显示:在九孔鲍MSTN基因中共筛选出9个SNP位点。SNP位点与生长性状关联分析发现,九孔鲍MSTN基因编码区SNP位点g909C>T发生C/T同义突变与九孔鲍体质量、壳长、壳宽显著相关。TT基因型九孔鲍的体质量显著高于CC基因型和TC基因型个体;TT基因型的壳长、壳宽显著高于CC基因型(p<0.05)。通过qRT-PCR检测显示,在九孔鲍MSTN基因SNP位点g909C>T的3种基因型中, TC和CC基因型的基因表达量显著高于TT基因型(p?0.05)。研究结果表明MSTN基因SNP位点g909C>T可作为九孔鲍标记辅助选择育种重要候选标记。

九孔鲍α-淀粉酶基因克隆、表达分析及与生长性状相关性

实验采用cDNA末端快速扩增(RACE)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)α-淀粉酶基因c DNA进行克隆,并分析该基因的组织表达及其与生长性状的相关性。结果表明,九孔鲍α-淀粉酶基因c DNA全长为2 260 bp,其中开放阅读框长度为2 088 bp,共编码695个氨基酸。经Singal P分析,α-淀粉酶多肽链中含有信号肽结构,且长度为18个氨基酸(MWAQYGIVSALLVLSASA),由该多肽链折叠成的三级结构中含有domain A、domain C 2个结构域,并且在domain A第28~第396氨基酸处存在催化中心。该基因在九孔鲍右侧壳肌、肠、肝脏、胃、外套膜、吻、腹足7种组织中均有不同程度表达。其中在胃中表达量最高,表达量高达326.803;而在外套膜中表达量最低,表达量仅为0.35。经ANOVA分析,消化组织与非消化组织间的α-淀粉酶基因表达量存在显著差异(P<0.05)。α-淀粉酶基因mRNA表达量与生长性状呈显著正相关(P<0.05)。

九孔鲍MSTN基因cDNA克隆及表达

肌肉生长抑制素(MSTN)是转化生长因子β超家族(TGF-β)中参与动物肌肉生长的重要调控因子。为了解MSTN基因在九孔鲍中的功能,本研究采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术从九孔鲍右侧壳肌中获得了MSTN基因c DNA全长,并运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了MSTN在各组织和发育时期的表达水平。结果显示,九孔鲍c DNA全长3 755 bp,其中5′非编码区(5′UTR)324 bp,3′非编码区(3′UTR)1 985 bp,开放阅读框(ORF)1 446 bp,编码481个氨基酸,分子质量为54.96 ku,理论等电点p I为9.41;具有N端信号肽(1~17 aa)、TGF-β前肽区域(157~367 aa)和成熟肽区域(379~481 aa),以及蛋白酶水解位点RRPR(364~368 aa)和C端生物活性区9个保守的半胱氨酸残基,符合TGF-β超家族蛋白典型结构特征,且预测到2个新的蛋白酶水解位点RQRR(120~124 aa)、RYRR(235~239 aa)。系统进化树结果显示,九孔鲍MSTN基因和红鲍MSTN基因聚为一支。q RT-PCR结果表明,九孔鲍MSTN基因在检测的6个组织中均表达,且在足、右侧壳肌、外套膜中高表达,在鳃、性腺、肝脏中低表达;在检测的7个发育时期均表达且在受精卵、原肠胚、稚鲍时期高表达,在卵、4细胞期、8细胞期、幼鲍时期表达量较低。研究表明MSTN基因可能在九孔鲍肌肉生长中具有重要作用。

九孔鲍BMP-2基因cDNA克隆及表达分析

为探究BMP-2基因在九孔鲍(Haliotisdiversicolorsupertexta)中的功能,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术从九孔鲍外套膜中获得了BMP-2基因cDNA全长,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了BMP-2基因在各组织和发育时期的表达水平。结果表明:九孔鲍BMP-2基因cDNA全长2572bp,其中5′非编码区(5′UTR)123bp, 3′非编码区(3′UTR)1150bp,开放阅读框(ORF)为1299 bp,编码432个氨基酸,其分子质量为48.59ku,理论等电点(pI)为9.84;具有N端信号肽(1-39 aa)、TGF-β前肽区域(63-294 aa)和TGF-β成熟肽区域(331-432 aa),以及蛋白酶水解位点RLRR (272-275 aa)和7个保守的半胱氨酸残基,符合TGF-β超家族蛋白典型结构特征。系统进化树结果显示九孔鲍BMP-2基因和耳鲍聚为一支。qRT-PCR结果表明BMP-2基因在九孔鲍的6个组织中均有表达,在足、右侧壳肌、外套膜及肝脏中显著高表达;在检测的7个发育时期均表达,其中在受精卵、4细胞、8细胞、原肠胚、稚鲍时期表达量显著高于卵、幼鲍时期。研究表明BMP-2基因可能在九孔鲍贝壳形成中具有重要作用。

盐度和胁迫时间对九孔鲍?-淀粉酶基因表达量的联合效应分析

采用中心复合设计和响应曲面法研究了盐度和胁迫时间对九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)?-淀粉酶基因表达量影响的联合效应,旨在为九孔鲍盐度驯化及海区推广提供指导。实验设定盐度范围为22~40,时间范围为0~72 h,建立了盐度、胁迫时间与?-淀粉酶基因表达量之间关系的定量模型,并通过分析明确了盐度和胁迫时间的最优组合。结果表明,盐度对九孔鲍?-淀粉酶基因表达量影响的一次效应不显著(P>0.05),而二次效应极显著(P<0.01),说明盐度与九孔鲍?-淀粉酶基因表达量之间为非线性关系。随盐度升高,淀粉酶基因表达量呈先上升后下降的变化趋势,当盐度为31时淀粉酶基因表达量最大,此时九孔鲍消化能力最强。胁迫时间对淀粉酶基因表达量影响的一次效应显著(P<0.05),二次效应不显著(P>0.05),表明胁迫时间与九孔鲍?-淀粉酶基因表达量之间呈线性关系,即随着胁迫时间的延长,淀粉酶基因从开始低水平表达逐渐升高并恢复至正常表达水平。盐度和胁迫时间之间不存在交互作用。对实验结果建立模型可知,?-淀粉酶基因表达回归模型达极显著水平(P<0.05),且失拟项不显著(P>0.05),表明实验拟合出的方程有效。回归方程的决定系数为80.05%,校正系数65.80%,预测系数50.18%,表明方程拟合度较好,模型选择较为恰当,可以为不同盐度和胁迫时间诱导下的淀粉酶基因表达量变化提供参考依据。

巨魾细胞色素氧化酶基因多态性及系统进化研究

采用PCR技术克隆得到12尾巨魾(Bagarius yarrelli)的细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)、细胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)和细胞色素氧化酶Ⅲ(COⅢ)的基因序列。结果显示:巨魾COⅠ基因序列全长1 551 bp,12个个体共出现9个单倍型,13个突变位点;COⅡ基因序列全长691 bp,12个个体共出现5个单倍型,5个突变位点;COⅢ基因序列全长784 bp,12个个体出现7个单倍型,8个突变位点。通过最小进化法Minimum Evolution(ME)构建系统发育树分析显示,巨魾与14种鮡科鱼在序列上有一定的同源性,并且COⅠ、COⅡ和COⅢ都与中华纹胸鮡(Glyptothorax sinense)、福建纹胸鮡(Glyptothorax fukiensis)、三线纹胸鮡(Glyptothorax trilineatus)和长丝黑鮡(Gagata dolichonema)在同一个分支,表明巨魾与纹胸鮡属和黑鮡属有较近的亲缘关系。