一种新型α-甲基查尔酮的制备、抗宫颈癌活性及对Akt-MDM2-p53信号通路的影响

课题组前期实验中发现,新疆胀果甘草中的微量特殊成分甘草查尔酮A(LicoA)具有较强的体外抗宫颈癌活性并对多种肿瘤干细胞标记物具有显著的下调作用,但是因其在胀果甘草中含量极低(约0.36%)^([1])并且合成制备成本昂贵,制约其开发利用。因此,本文旨在对LicoA进行结构修饰,合成一种具有替代LicoA潜力的新型查尔酮类化合物并研究其抗宫颈癌活性。

哌嗪-查尔酮衍生物的合成及抗宫颈癌活性

以甘草查尔酮为先导化合物,采用药效团拼合原理,设计、合成系列新型查尔酮类衍生物,并通过1H-NMR、^(13)C-NMR和HR-MS进行表征确认其结构。选用人宫颈癌HeLa、SiHa、C33A、HeLa/DDP细胞、人宫颈正常H8细胞和人脐静脉内皮HUEVC细胞为体外模型,对目标化合物进行增殖抑制活性测试,并采用Elisa法、联合顺铂用药、Western Blot和分子对接技术,对化合物7h与VEGFR-2和P-gp靶点进行初步研究。结果表明,化合物7h的抗癌活性较显著且对正常细胞的毒性低,对VEGFR-2和P-gp靶点具有一定抑制作用,并能够与靶点周围的氨基酸残基形成氢键相互作用力。

基于CADD探究新疆胀果甘草查尔酮A对宫颈癌细胞增殖、凋亡作用及其分子机制

以新疆胀果甘草查尔酮A(licochalcone A,LicoA)为物质基础,研究其对宫颈癌细胞的增殖抑制活性、促凋亡作用及对周期的影响,并对其分子机制进行初探。从新疆胀果甘草中提取LicoA单体成分,通过1H NMR、13 C NMR及HR-EI-MS进行结构表征;通过MTT法检测在不同浓度下LicoA对人宫颈癌细胞(SiHa和HeLa)的抑制率并计算IC 50值,选取SiHa细胞为研究对象,采用流式细胞术,以AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,并测定对细胞周期的影响。通过CADD法预测LicoA作用靶点,荧光定量RT-PCR法检测宫颈癌肿瘤干细胞标记物(Bcl-2、ALDH1A1、OCT-4、UHRF1、BIRC7、BIRC5)基因及细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)基因的mRNA表达量。结果显示,LicoA能显著抑制2种宫颈癌细胞增殖,且呈现显著的时间和浓度依赖性;随着LicoA浓度的增加,细胞增殖速度减慢,细胞呈皱缩形态;LicoA诱导细胞凋亡作用显著,在30μg/mL时,SiHa细胞凋亡率达52.0%;LicoA可能将SiHa细胞的增殖周期阻滞在S期和G 2/M期;分子对接结果显示对CDK4蛋白有较好结合能力,预测可能具有较强的抑制作用;LicoA显著下调宫颈癌肿瘤干细胞标记物(Bcl-2、ALDH1A1、OCT-4、UHRF1、BIRC7、BIRC5)的表达量,同时抑制周期相关基因CDK4的mRNA表达。LicoA抑制宫颈癌细胞增殖的机制可能是通过将SiHa细胞的增殖周期阻滞在S期和G 2/M期,诱导细胞凋亡及抑制细胞分化。

甘草查尔酮B及其衍生物的制备及抗宫颈癌活性

目的提取新疆胀果甘草中的总黄酮,分离纯化甘草查耳酮B,合成三甲氧查耳酮B,对比研究其体外抗宫颈癌活性。方法采用超声辅助乙醇提取法提取总黄酮;结合聚酰胺与大孔吸附树脂法纯化总黄酮;通过薄层法从总黄酮中分离纯化单体查耳酮B(化合物Ⅰ);同时,以取代苯乙酮和取代苯甲醛为原料,Claisen-Schmidt碱催化方法合成三甲氧查尔酮B(化合物Ⅱ);以人宫颈癌SiHa和HeLa细胞为体外药理实验模型,以顺铂为阳性对照,用噻唑蓝比色法对比测定2个单体化合物对宫颈癌细胞增殖的抑制活性。结果在浓度为1~100μg/mL时,化合物I对SiHa和HeLa细胞作用24、48、72 h时的抑制率为2.99%~75.39%;而化合物Ⅱ在此浓度范围内的抑制率为0.76%~86.14%。结论超声辅助乙醇回流提取法联用聚酰胺和大孔树脂柱层析法是制备含量较高的胀果甘草总黄酮的可行方法;甘草查尔酮B的甲氧基化修饰可显著提高其抗宫颈癌活性。

新型三氟甲基查耳酮类衍生物的设计、合成及体外抗宫颈癌活性

查耳酮类化合物是一种多酚类黄酮物质,具有多种药理活性,毒性较低。本研究以天然甘草查耳酮母核为先导化合物骨架,设计合成了15个新型三氟甲基查耳酮类衍生物(3a~3o)。目标化合物结构经^(1)H NMR、^(13)C NMR和HRMS进行确认。采用MTT法测定化合物3a~3o、甘草查耳酮、顺铂和Nutlin3a对SiHa、HeLa、C-33A等3种人宫颈癌细胞和H8、HaCaT等两种正常细胞的增殖抑制活性,并进行构效关系分析;采用Transwell法和流式细胞仪法评价目标化合物抑制癌细胞迁移侵袭、促凋亡、阻滞细胞周期的能力。通过分子对接技术研究目标化合物与Akt-MDM2-p53通路中MDM2蛋白的结合特征。结果显示,目标化合物对3种宫颈癌细胞的增殖具有不同程度的抑制活性。其中,化合物3n对HeLa细胞的活性最强(IC_(50)=11.69μmol/L),明显优于先导化合物,并对两种正常细胞的毒性较低;化合物3n能显著抑制HeLa细胞的迁移和侵袭,诱导癌细胞凋亡,并将细胞周期阻滞在G2/M期。分子对接结果显示,化合物3n能与MDM2蛋白有效结合(结合能为-38.1 kJ/mol),具有抑制MDM2蛋白作用。本研究为新型有效低毒的查耳酮类抗肿瘤候选药物筛选提供了实验依据。

4-氯-2′,4′-二甲氧基查尔酮的合成及MDM2蛋白分子对接研究

目的合成4-氯-2′,4′-二甲氧基查尔酮(化合物I),研究其与鼠双微体蛋白2(MDM2)分子对接的结合能量和位点。方法采用研磨法,以4-氯苯甲醛和2,4-二甲氧基苯乙酮为原料,制备化合物I;通过Autodock软件对化合物I与MDM2蛋白进行分子对接,测定化合物结合能量及结合位点。结果合成目标化合物化合物I,产率为87.21%,经核磁氢谱碳谱表征确定为化合物I。与MDM2分子对接后,结合能量为-7.2 kcal/mol,化合物I与MDM2蛋白中的氨基酸残基Tyr-67和Lys-94的侧链形成CH-π和阳离子-π相互作用。结论化合物I易于合成,产率较高,分子对接展现较好结合能力,对MDM2蛋白具有较强的抑制作用。

2,3,4-三甲氧基查耳酮类衍生物的合成及体外抗宫颈癌活性研究

目的研究以甘草查耳酮B为先导化合物合成的3个查耳酮类衍生物的体外抗宫颈癌活性、对宫颈癌细胞增殖周期的影响及促凋亡作用。方法以取代苯乙酮和取代苯甲醛为原料,通过Claisen-Schmidt反应合成2,3,4-三甲氧基查耳酮类衍生物;采用人宫颈癌SiHa和HeLa细胞体外模型,以顺铂为阳性对照品,采用MTT法测定2,3,4-三甲氧基查耳酮类衍生物对宫颈癌SiHa和HeLa细胞的增殖抑制活性;用流式细胞仪法测定对2种宫颈癌细胞增殖周期的影响和促凋亡作用。结果合成2,3,4-三甲氧基-4′甲氧基查耳酮(衍生物1),2,3,4-三甲氧基-2′,4′-二甲氧基查耳酮(衍生物2),2,3,4-三甲氧基-3′,4′-二甲氧基查耳酮(衍生物3)。当浓度为1~100μg/mL范围内,各衍生物对SiHa和HeLa细胞作用24、48、72 h时的增殖抑制率为6.6%~89.8%,抑制特征呈浓度和时间依赖型,抑制率高于先导化合物查耳酮B。其中衍生物3的活性最高,对SiHa和HeLa细胞的24 h凋亡率为15.0%~85.6%,可将HeLa细胞的增殖周期阻滞在G_2/M期。结论Lico B结构修饰后所得衍生物2,3,4-三甲氧基-3′,4′-二甲氧基查耳酮对宫颈癌SiHa和HeLa细胞有较强的抑制作用。

新型吡咯烷-查尔酮类衍生物的设计、合成及抗宫颈癌活性研究

目的设计、合成系列新型氮杂查尔酮类衍生物并研究其抗宫颈癌活性和作用机制。方法以甘草查尔酮为先导化合物,以VEGFR-2和P-gp为靶点,采用活性亚结构拼接原理,设计并合成一系列新型查尔酮类衍生物,利用^(1)H-NMR、^(13)C-NMR和HR-MS对结构进行表征。采用MTT、ELISA、联合顺铂用药、Western blotting和分子对接试验,初步评价了目标化合物对宫颈癌和顺铂耐药宫颈癌细胞的增殖抑制活性及作用机制。结果化合物7h具有一定的抗肿瘤活性和逆转顺铂耐药作用,对VEGFR-2及下游PI3K/AKT信号通路蛋白的磷酸化具有一定的抑制作用,并在0.5,1.0,1.5μmol·L^(-1)浓度内对P-gp蛋白表达量与空白组相比无显著性差异。结论化合物7h的抗宫颈癌活性和逆转顺铂耐药作用,可能与其抑制了VEGFR-2和P-gp靶点有关。

新型α-甲基查尔酮类衍生物的合成及体外抗宫颈癌活性研究

目的以查尔酮母核为先导化合物,设计合成α⁃甲基查尔酮类衍生物并进行体外抗宫颈癌活性研究。方法以2,4⁃二氯苯丙酮与取代苯甲醛为原料,经Claisen⁃Schmidt反应合成一系列新型α⁃甲基查尔酮类衍生物3a~3k,其结构经^(1)H⁃NMR、^(13)C⁃NMR及HR⁃ESI⁃MS谱确证。通过MTT法测定3a~3k对人宫颈癌细胞(SiHa和HeLa)及中国仓鼠正常卵巢细胞(CHO)的体外抗增殖活性;采用流式细胞仪技术检测3g对HeLa细胞的促凋亡作用及对细胞周期的影响;通过CADD法对3g与鼠双微粒体2(MDM2)和微管蛋白进行分子对接,测定化合物结合能量及结合位点。结果与结论3a~3k对人宫颈癌细胞株均表现出不同程度的抗增殖作用,其中3g对HeLa细胞的抑制活性最显著,IC_(50)值为16.51μmol·L^(-1);3g对HeLa细胞作用24h凋亡比例高达84.06%;主要阻滞HeLa细胞于S期;分子对接结果预测3g对MDM2蛋白及微管蛋白均具有较强的抑制作用。