去整合素样金属蛋白酶8的N-糖基化及其在神经胶质瘤细胞增殖和转移中的作用

目的阐明去整合素样金属蛋白酶8(ADAM8)的N-糖基化在胶质母细胞瘤增殖和转移中的作用。方法该研究起止时间为2023年6—9月。选用胶质母细胞瘤细胞株U251和U87进行实验。细胞分为两组:对照组(不处理)和处理组[使用N-糖苷酶F(PNGase F)和衣霉素破坏N-糖基化]。处理组通过点突变技术替换ADAM8的4个潜在N-糖基化位点的天冬酰胺(Asn)残基,构建突变体N67Q、N91Q、N436Q和N612Q,依次设为N67Q组、N91Q组、N436Q组和N612Q组。随后,利用蛋白质印迹法检测突变体的蛋白加工情况,并通过共聚焦显微镜观察其亚细胞定位。使用溶酶体抑制剂比较野生型和N436Q突变体的蛋白稳定性。最后,转染不同突变体至U87细胞,评估其对细胞存活、增殖、迁移和侵袭的影响。结果胶质母细胞瘤细胞中的ADAM8蛋白4个位点(Asn-67,Asn-91,Asn-436和Asn-612)经历N-糖基化修饰,并且这4个位点在细胞中具有功能重要性。ADAM8蛋白的N91Q和N612Q突变体会导致定位改变,而N67Q和N436Q突变体与野生型ADAM8类似,N436Q突变体中ADAM8蛋白的稳定性降低。与对照组(0.23±0.05、0.49±0.03、0.73±0.05、1.41±0.06)相比,N67Q组(0.21±0.04、0.43±0.02、0.61±0.03、0.93±0.04)、N91Q组(0.25±0.07、0.36±0.02、0.44±0.04、0.84±0.06)、N436Q组(0.23±0.04、0.32±0.04、0.35±0.06、0.51±0.07)、N612Q组(0.25±0.04、0.39±0.05、0.52±0.02、0.76±0.03)U87细胞0、24、48、72 h存活率均降低(均P<0.05)。与对照组[(280.38±17.29)个/微升]相比,N67Q组[(187.29±16.48)个/微升]、N91Q组[(142.18±17.04)个/微升]、N436Q组[(32.19±14.28)个/微升]、N612Q组[(146.63±18.25)个/微升]U87细胞增殖能力均降低(均P<0.05)。与对照组[(98.76±7.56)个/微升]相比,N67Q组[(83.19±7.19)个/微升]、N91Q组[(69.37±6.73)个/微升]、N436Q组[(63.27±6.35)个/微升]、N612Q组[(74.28±7.01)个/微升]U87细胞划痕能力均降低(均P<0.05)。与对照组[(102.19±7.34)个/微升]相比,N67Q组[(70.21±7.13)个/微升]、N91Q组[(49.07±6.16)个/微升]、N436Q组[(16.28±3.24)个/微升]、N612Q组[(39.71±4.37)个/微升]U87细胞侵袭能力均降低(均P<0.05)。转染N-糖基化缺陷的ADAM8突变体的U87细胞表现出波形蛋白和紧密连接蛋白1(Claudin-1)蛋白水平的下降,而上皮钙黏素(E-cadherin)上升。结论ADAM8的N-糖基化促进了胶质母细胞瘤细胞的增殖和转移。N-糖基化位点突变抑制了细胞的恶性表型。