日本血吸虫精氨酸酶的克隆表达及酶活性分析

为解析日本血吸虫精氨酸酶的功能,本研究克隆了SjARG基因、长度为1095 bp,并将该基因克隆一到原核表达载体pET-28a,获得重组质粒pET-28a-SjARG,并在大肠杆菌中成功表达,Western blot显示重组蛋白具有良好的抗原性;通过酶活性分析显示,重组蛋白SjARG在添加Mn2+后活性得到提高,酶活性大小为502 U/mg,Km值为82.7mM。该研究结果为进一步深入研究该基因的表达特性、酶学性质以及候选疫苗分子研究方面提供了基础。

pVAX1/SjTSP2 DNA疫苗免疫预防小鼠日本血吸虫病的效果评估

为评估SjTSP2分子作为日本血吸虫DNA疫苗候选抗原分子的潜力,本实验扩增了编码该分子的DNA片段,构建了重组真核质粒pVAX1/SjTSP2,检测其在哺乳动物细胞中表达情况后,通过基因枪轰击法免疫小鼠,应用ELISA、流式细胞术等检测重组质粒诱导的免疫反应,计算减虫减卵率,评估对小鼠日本血吸虫病的免疫保护效果。间接免疫荧光试验结果显示该质粒能在293T细胞中表达。质粒免疫小鼠诱导了显著升高的特异性IgG抗体和IFN-γ、IL-4等细胞因子。小鼠免疫保护试验结果表明,免疫组小鼠虫荷数较PBS对照组增加12.4%(P=0.368),但肝组织虫卵减少10.01%(P=0.486)。说明制备的DNA疫苗能刺激小鼠产生较强的免疫反应,但诱导的免疫保护作用并不理想,为血吸虫DNA疫苗研究提供了参考数据。

日本血吸虫SjZFP1 181-786bp基因序列编码蛋白的免疫保护效果评估

根据日本血吸虫锌指蛋白SjZFP1的抗原位点预测结果,选取编码基因中抗原表位富集的181~786 bp核苷酸序列(SjZFP1-1)表达制备重组蛋白抗原rSjZFP1-1/His,构建重组真核表达质粒pcDNA-SjZFP1-1,并开展动物免疫实验,评估免疫保护效果。在两次独立的免疫实验中,与相应对照组相比,rSjZFP1-1/His单独免疫组以及pcDNA-SjZFP1-1与rSjZFP1-1/His联合免疫组均产生较高水平的特异性抗体,但平均虫负荷、肝脏虫卵数无显著性减少。研究结果显示rSjZFP1-1/His不能诱导有效的抗感染免疫,今后可进一步开展SjZFP1蛋白N-端肽段编码序列的表达和效果评估。

日本血吸虫视黄酸X受体2全长cDNA的克隆及初步分析

目的克隆编码日本血吸虫视黄酸X受体2(SjRXR2)蛋白的全长cDNA,并对其进行初步研究。方法利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得SjRXR2蛋白全长编码cDNA。利用生物信息学技术,对基因结构进行初步分析。利用实时荧光定量(Real time)PCR技术对该基因在日本血吸虫不同时期虫体中的转录情况进行分析。应用在线抗体表位预测软件获得SjRXR2配体结合区抗原性较强的一个多肽序列,合成该多肽片段,并免疫小鼠制备抗血清。利用Western blot技术分析该蛋白在日本血吸虫中的表达。结果采用RACE技术成功获得了SjRXR2蛋白全长编码cDNA,总长度为5 960bp,其完整开放阅读框为4 308 bp,编码1 435个氨基酸,预测分子量为159 kDa。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白质序列具有核受体家族2的典型结构域特征,且与曼氏血吸虫RXR2有较高的相似性。Real time PCR分析表明,该基因在21、42 d龄日本血吸虫虫体内有较高的转录水平。Western blot分析表明,小鼠SjRXR2多肽免疫血清可特异性识别日本血吸虫虫体150 kDa蛋白。结论成功获得了编码SjRXR2蛋白的全长cDNA,并制备了针对该蛋白的特异性多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

日本血吸虫章鱼胺受体基因的克隆表达及分析

为克隆日本血吸虫章鱼胺受体(SjOAR)基因,揭示其表达情况以及表达产物的分布情况,利用PCR方法克隆了SjOAR基因。Blast分析表明,该基因与终末宿主对应的肾上腺素受体基因的同源性较低。利用大肠杆菌表达了受体蛋白的保守区段。Western-blot分析结果表明,重组蛋白能被成虫抗原抗血清识别,其特异性抗体也能识别天然受体蛋白。实时定量RT-PCR分析结果显示,SjOAR基因在血吸虫的童虫和成虫中转录差异不大。免疫组化观察显示,该受体蛋白在日本血吸虫体被下方的肌层和生殖系统中分布较多。结果表明,日本血吸虫章鱼胺受体有作为抗血吸虫药物研究靶标的潜力。

日本血吸虫dysferlin基因的克隆及重组蛋白免疫原性的分析

为评估日本血吸虫dysferlin重组蛋白(rSjDF)的免疫原性,利用PCR技术扩增SjDF基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-SjDF,诱导表达重组蛋白rSjDF,并用重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗体。应用间接免疫荧光技术对SjDF进行蛋白组织定位。应用Western-blot、ELISA及Bio-Plex悬液芯片技术检测重组蛋白诱导的免疫反应。间接免疫荧光试验表明SjDF主要分布于血吸虫体被表膜。Western-blot结果显示rSjDF能被该重组蛋白免疫小鼠血清识别,具有良好的免疫原性。rSjDF能诱导小鼠产生高水平的特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体和IL-2、IL-4、IL-12p70、IL-10、IFN-g等细胞因子。结果表明,制备的重组抗原能刺激小鼠产生较强的免疫反应,为筛选新的血吸虫疫苗候选分子奠定了基础。

日本血吸虫SjIrV1的基因特性及免疫保护效果

钙结合蛋白是日本血吸虫生长发育不可缺少的蛋白,具有非常广泛而重要的功能。在课题组日本血吸虫体被表膜蛋白研究基础上,利用PCR技术克隆了中国大陆株日本血吸虫66 kDa钙结合蛋白(SjIrV1)编码基因的cDNA序列,BLAST分析与菲律宾株日本血吸虫SjIrV1 cDNA编码序列一致,荧光定量PCR分析表明该基因在童虫和成虫期不同发育阶段均有表达,其中在35 d和42 d成虫中表达量较高,在42 d雌虫中该基因表达水平远高于42 d雄虫。构建重组表达质粒pET28a(+)-SjIrV1,在大肠杆菌中成功诱导表达,重组蛋白主要以可溶性形式存在,通过高效液相色谱法(RP-HPLC)以及串联质谱法(MS/MS)鉴定所获蛋白为目的蛋白SjIrV1。蛋白质印迹(Western blotting)分析结果显示重组蛋白能被感染日本血吸虫鼠血清和免疫鼠血清所识别,SjIrV1蛋白在虫体各发育阶段中均表达。免疫荧光染色实验观察表明SjIrV1主要分布在日本血吸虫成虫的表膜。应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,免疫鼠血清中检测到较高水平的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体。结果表明SjIrV1可能在日本血吸虫的生长发育过程中起着重要作用。