大鼠脊髓胶状质内含P物质(SP)及脑啡肽(ENK)神经终末的超微结构

水文应用超微免疫组织化学技术探讨正常及切断后根大鼠胶状质(SG)内P物质(SP)及脑啡肽(ENK)轴突终末的分布及其突触联系。电镜观察发现:SP或ENK免疫反应产物主要分布于轴突终末的大颗粒囊泡的内面,小清亮囊泡及线粒体的外表面,在未应用秋水仙素的情况下,ENK样免疫反应性也可出现于树突及核周质,但电子密度较低。大量的含SP或ENK的终末,分别和未标记树突形成突触。但也偶然见到肽能神经终末与未标记轴突或胞体接触或形成突触联系。常遇到三或四联体,亦偶可见到以含SP轴突终来为中心的突触球。切断后根,手术侧既可见到变性轴突(SP阳性)与未标记轴突接触,又可见到ENK阳性轴突终末与溃变轴突接触,但为数不多。因此认为:通过SP阳性一级传入细纤维传递的感觉信息既可汇集于神经元的一个树突又可多向传递于若干个神经元。ENK在胶状质的抑制作用主要为突触后,但ENK对含SP的一级传入纤维的突触前抑制也不能排除。

中枢乙酰胆硷在针刺镇痛中的作用

十余年来针刺镇痛原理研究室以多学科密切配合，亦即应用临床与基础，形态与机能以及静态测定与动态分析相结合的方法，从不同角度对乙酰胆碱在针刺镇痛中的作用进行探讨，研究证明：

硬脊膜外注射辣椒素对大鼠痛阈及电针镇痛效应的影响

一般认为,伤害性刺激的一级传入纤维主要为含P物质(SP)的C类纤维,其胞体是脊神经节内的B型细胞。关于C类纤维在电针信息传入中的作用,至今仍存在争议。众多资料表明。

硬脊膜外腔注入辣椒素对大鼠脊髓后角内SP、ENK及FRAP的影响

组织化学观察发现:大鼠硬脊膜外腔注入辣椒素后第7天,与溶媒对照组比较.脊髓后角Ⅰ一Ⅲ层内与一级感觉传入有关的神经递质P物质(SP)的免疫反应性(SP-IR)明显减弱,而与一级传入的调控有关的亮氨酸脑啡肽(ENK)的免疫反应性(ENK-IR)明显增强;同时后角Ⅱ层内及脊神经节A型细胞内一级传入C类纤维的标志酶抗氟化物酸性磷酸酶(FRAP)的反应产物消失.功能测定表明,应用辣椒素后,动物的痛阈明显升高,溶媒对痛阈无明显影响.由此提示:硬脊膜外腔注入辣椒素能有效地作用于一级传入C类纤维,影晌其递质水平、酶的活性及信息传导功能;这类辣椒素敏感的C类纤维与脊髓后角内含ENK的中间神经元之间可能存在着密切联系.

电针对大鼠脊髓背角乙酰胆碱代谢的影响

本文从代谢的角度就针刺镇痛时乙酰胆碱(ACh)含量,胆碱乙酰化酶活性(ChAC)和胆碱酯酶(ChE)活性3个环节上进行了综合研究。发现:针刺镇痛时大鼠脊髓背角ACh含量与单纯测痛大鼠((?)±s为2.088±0.319ng/mg组织)比较无明显变化,但合成酶ChAC及降解酶ChE活性明显升高,ChAC活性(以每mg组织孵育30min所生成的AChng表示)从0.626±0.150ng/mg升高到1.344±0.317ng/mg,ChE活性(以每g组织每分钟水解的ACh mmol表示)从0.978±0.089mmol/g组织升高到3.150±0.206mmol/g组织,说明针刺镇痛时ACh代谢明显加快,是ACh参与针刺镇痛的证据。

脊髓后角神经降压肽和P物质的免疫细胞化学双标法研究——光镜和电镜观察

本文用PAP法在同一切片上作双重免疫染色以二氨基联苯胺DAB和二盐酸联苯胺BDHC作显色剂,对经秋水仙素处理的大鼠脊髓后角内神经降压肽(NT)和P物质(SP)的免疫反应性进行光镜和电镜研究。实验中发现,DAB与BDHC的反应产物具有明显的区别,光镜下,前者为棕色,后者为蓝色;在电镜下,DAB反应产物呈均匀,弥散的电子致密体,而BDHC反应产物呈斑块状电子致密体。这种新的而又简单的方法能在同一张超薄切片上同时显示两种抗原物质,这将有利于进一步研究两种不同的神经元之间的结构和功能关系。本研究发现,NT样免疫阳性反应胞体主要位于第Ⅱ层和Ⅲ层外部,终末位于Ⅰ—Ⅲ层。电镜下,NT阳性反应轴突终末可与未标记轴突或树突构成突触。SP样阳性反应胞体主要位于Ⅱ层,在Ⅰ、Ⅱ层有较高密度的终末。电镜下观察到存在轴(SP)—轴(SP)和轴(SP)—体(SP)突触。在双重NT染色切片上,电镜下发现阳性轴突终末能与SP轴突终末形成触或接触。本研究结果提示:脊髓后角内含NT和含SP的神经元可能参与一级感觉信息的调制过程。

鸟核苷酸调节蛋白在大鼠脑和脊髓内免疫组织化学定位

本研究应用兔抗鸟核苷酸调节蛋白α_0亚单位(简称α_0)多克隆血清(抗体),采用免疫组织化学方法对大鼠脑和脊髓内一些结构中的α_0作了定位观察.发现α_0样免疫反应性(α_0-Li)在大鼠脑内的分布比较广泛,各脑区表现出分布不均,神经网织中呈高密度,神经元核周质缺乏或其少,α_0-Li主要位于胞体膜及其突起上.最强的α_0-Li见于黑质(网织部),脚间核及缰—脚间束,海马多形细胞层,辐射层和脊髓胶状质;中度染色者有:大脑皮质、小脑皮质及海马的分子层,缰核,尾壳复合体,中脑导水管周围灰质,上丘灰质,延髓三叉神经脊束及延髓橄榄小脑束,丘脑和下丘脑中线核群。但隔核,苍白球,红核,脊髓中央管周围灰质α_0-Li相对较弱.另外,发现在中脑导水管周围灰质、黑质、中脑网状结构、内侧膝状体及斜方体核区内一些神经元核周质及其突起上,存在有α_0-Li.AChE染色证明,0在一些α_0—Li阳性区域:大脑皮质分子层,海马,延髓三叉神经脊束及脊髓胶状质等,也富含AChE阳性(胆碱能?)神经末梢.结果提示,脑内G_0蛋白的α_0亚单位在膜信息传递中可能与胆碱能神经成分有一定关系。

背根切断及辣椒素处理大鼠脊髓内阿片受体与P物质的变化

本文探讨了免疫组织化学与阿片受体放射自显影相结合的方法。在相邻切片上同时观察P物质免疫组织化学和阿片受体放射自显影定位,并观察了背根切断及辣椒素处理后对大鼠脊髓内SP—免疫反应(SP—IR)及阿片受体分布的影响。结果发现:脑组织经1％甲醛固定12小时,~3H—ctorphine结合的最大结合容量及亲和常数基本上不受影响,自显影发现固定后脊髓内阿片受体(银粒)分布特异,未出现正。

硬脊膜外腔注射辣椒素对大鼠一级传入C纤维的影响——组织化学与电镜观察

本文应用组织化学与电镜方法,观察了硬脊膜外腔注射辣椒素(CAP)对成年大鼠一级传入C纤维的影响。经CAP处理后第7天,大鼠脊髓后角Ⅰ～Ⅲ层内P物质(SP)免疫反应性明显减弱,抗氟化钠酸性磷酸酶(FRAP)活性消失或明显减弱,但亮氨酸脑啡肽(LEK)、神经降压素(NT)及5-羟色胺(5-HT)免疫反应性无明显变化。电镜观察发现,CAP处理后脊神经后根内部分无髓神经纤维被破坏,但有髓神经纤维无变化。在给药后48小时的脊髓胶状质(SG)内即可出现变性(DEG)终末,在第5、7、和10天,DEG终末增多,DEG程度加重。部分DEG终末属于Ⅰ型突触球的中央终末,但Ⅱ型突触球的中央终末无DEG征象。以上结果表明,成年大鼠硬脊膜外腔注射CAP亦可有效而特异地损毁一级传入C纤维。此动物模型的建立为选择性地研究C纤维与SG内其它结构之间的超微联系奠定了基础,并在进一步研究C纤维的功能方面具有一定的实用价值。

甲醛固定对阿片受体结合能力的影响

应用放射受体分析和体外受体放射自显影技术,研究了甲醛固定对阿片受体结合能力的影响。结果表明,1％多聚甲醛溶液中孵育30分钟或12小时,对大鼠脑膜阿片受体结合能力均无显著影响; 2％或4％多聚甲醛溶液中孵育30分钟,对阿片受体结合能力也无显著影响。经甲醛固定的脑切片上的阿片受体,与[~3H]-埃托啡结合的饱和曲线与新鲜脑切片的相似。用1％多聚甲醛固定的组织切片进行体外受体放射自显影,较好地显示了阿片受体的分布。这些结果提示,甲醛固定的组织可用于进行体外受体放射自显影研究。

5-HT神经元上阿片受体的放射自显影显示术

经多年研究,现已查明中脑导水管周围灰质(PAG)及位于其腹侧的中缝背核(NDR)在镇痛中起重要作用;PAG和NDR中有脑啡肽能神经元和丰富的阿片受体存在;NDR中含大量5-HT能神经元,其传出纤维广泛分布于前脑和间脑,并有纤维下行至脊髓后角;吗啡微量注入至PAG或电刺激PAG能引起镇痛。因此有人认为这种镇痛作用是直接或间接通过阿片受体而实现的。

电针对脊髓背角内ACh代谢的影响

脊髓背角是感觉传入的重要中继站，为了探明脊髓背角内ACh在针刺镇痛中的作用，本文将从代谢的角度以动态变化的观点就针刺镇痛时ACh含量，和ACh合成酶及降解酶的活性等三个环节上进行综合研究。实验用SD纯种成年健康大白鼠72只随机分成两大组，每组中又分电针组和对照组，第一大组，测ACh含量和ACh的合成酶——胆碱乙酰化酶(ChAC)，第二大组测ACh的降解酶——胆碱酯酶(ChE)。若将电针诱导10、20、30分钟时痛阈进行相关分析发现镇痛效应与电针强度呈直线正相关。

乙酰胆碱与感觉一级传入——大白鼠脊髓后角M受体放射自显影实验研究

本研究应用[~3H]二苯羟乙酸奎宁酯([~3H]QNB)放射自显影(ARG)和放射受体分析法(RRA)研究了大白鼠脊髓腰段M受体的正常分布,以及切断背根,辣椒素处理条件下脊髓后角胶状质内M受体的变化,并结合酸性磷酸酶(AcP)和乙酰胆碱酯酶(AChE)组织化学研究其与一级传入的关系。结果发现:

外周ACh在针刺镇痛中的作用

中枢ACh参与针刺镇痛已被证明。为了探明外周ACh是否参与针刺镇痛和针刺信息的传人，我们进行了一些实验性研究。结果发现：

大鼠脊神经节内交感神经支配的荧光组织化学与HRP示踪观察

本研究应用乙醛酸诱发儿茶酚胺（ＣＡ）荧光技术观察大鼠肾上腺素（ＮＡ）能神经在脊神经节内的分布；并应用ＨＲＰ顺、逆行追踪技术对脊神经节内ＮＡ能神经纤维的起源及其与脊神经节神经元的关系进行了探讨。荧光组织化学观察发现、有些神经节神经元胞体周围分布有带膨体的ＮＡ能神经末梢；有的紧密围绕脊神经节细胞——卫星细胞复合体。颈上交感神经节内注射霍乱毒素Ｂ亚单位结合ＨＲＰ（ＣＢ┐ＨＲＰ），在同侧Ｃ３～６节段脊神经节内可见标记的点状纤维末梢紧邻于节细胞旁。Ｔ１１～Ｌ２节段脊神经节内注射ＨＲＰ后，在同侧椎旁交感链（Ｔ９～Ｌ１）内可见标记的交感节后神经元胞体。上述实验结果表明，交感节后神经元发出节后纤维可直接到达脊神经节内，与节细胞发生接触。本研究提示。

新生大鼠辣椒素处理后脊髓内阿片受体的变化

本实验用受体放射自显影方法，研究了新生大鼠辣椒素皮下注射，成年后脊髓内３Ｈ－埃托菲（３Ｈ－ｅｔｏｒｐｈｉｎｅ）结合位点数的变化。发现新生鼠辣椒素处理可以引起脊髓后角浅层及中央管周围’Ｈ－ｅｔｏｒｐｈｉｎｅ结合位点明显减，其中Ⅰ、Ⅱ层自显影银粒数减少３６％左右。Ⅲ层减少２０％，中央管周围减少１１％。而前角及背外测束３Ｈ－ｅｔｏｒｐｈｉｎｅ结合位点数无显著性差异。结果表明脊髓内初级感觉传入细纤维上有阿片受体分布。本研究为探明阿片类物质在脊髓水平的痛觉调控机制提供一定的形态学依据。

硬脊膜外腔注射辣椒素对大鼠电针镇痛效应的影响

对大鼠硬脊膜外腔注射100μg辣椒素后，第7天电针镇痛效应较给药前及对照组明显降低；腰骶段脊髓后角P物质样免疫反应性(SP-LI)减弱和抗氟化物酸性磷酸酶(M)反应产物减步，而亮氨酸脑啡肽样免疫反应性(ENK-LI）增强；脊神经节B型细胞内FRAP反应产物消失。以上结果提示，大鼠硬脊膜外腔注射辣椒素可影响一级传入C类纤维(特别是SP纤维)以及脊髓后角Ⅰ-Ⅲ层含ENK中间神经元的代谢和功能；一级传入C类纤维(包括SP纤维)在针刺信息传入及针刺镇痛中具有重要作用。

大鼠脊髓胶状质含亮啡肽终末与辣椒素敏感的C纤维终末的超微联系

本文应用免疫电镜术观察到,在大鼠脊髓胶状质内,亮啡肽(LEK)阳性的轴突终末与某些未标记神经元的树突、或树突棘、或胞体形成突触。其中一些轴(LEK)树(未标记)突触为对称性的。因此。在胶状质内,LEK神经元可以突触后抑制方式影响其它神经元的活动。LEK终末之间的对称性轴轴突触提示LEK终末可能具有自身调节作用。我们也发现少量的LEK终末与由硬脊膜外注射辣椒泰所致的一级传入C纤维变性(DEG)终末之间也存在直接和间接联系。这些联系包括以下几种:(1)轴(DEG)→树(LEK)突触;(2)轴(LEK)→轴(DEG)突触样接触;(3)轴(DEG)→树(未标记)←轴(LEK)三联体。这些联系分别提示:(1)一级传入C纤维可直接兴奋胶状质内含LEK的中间神经元,这可能是LEK对痛信息传递进行负反馈调节的机制之一;(2)LEK通过轴轴突触对一级传入C纤维的活动进行突触前抑制的可能性不能排除;(3)LEK可通过对上述三联体中的未标记树突进行抑制来间接调节一级传入C纤维的传入信息。此外,由未标记轴突终末与变性终末所形成的轴轴突触的存在提示,胶状质内非亮啡肽神经元也可通过轴轴突触以突触前抑制影响一级传入C纤维的功能。

中枢乙酰胆碱与针刺镇痛关系的研究

乙酰胆碱(Ach)不论在种系发生或个体发生上都是最早出现的神经递质,在某些低等动物感觉传入神经全部是胆碱能的,高等动物痛觉的神经通路有一部分也和上行胆碱能网状激活系统一致;脑内一些重要的与痛和镇痛有关的结构是胆碱能的;因此我们认为 Ach