金葡素SEC2改构蛋白2M-118对小鼠的致呕吐、致热毒性和免疫原性作用

为了探究金葡素SEC2(Staphylococcal enterotoxins C 2)改构蛋白2M-118对小鼠的致呕吐、致热毒性和免疫原性作用,将BALB/c小鼠分为正常组、2M-118腹腔给药组和灌胃给药组,每组10只;通过观察小鼠给药前后状态变化及记录小鼠体质量和体温,评价2M-118对小鼠的致呕吐和致热毒性;采用MTT法检测2M-118对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响;由ELISA法检测小鼠给药2M-118后血清产生中和抗体的情况。结果表明,2M-118并未致小鼠呕吐或致小鼠体温升高;2M-118可以刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,促进脾组织中IFN-γ、TNF-α和IL-2等细胞因子的表达,并刺激机体产生针对2M-118的中和抗体。

鸡p15^(INK4B)基因的克隆表达及纯化

为研究鸡p15INK4B蛋白的功能及为制备此蛋白的单克隆抗体提供材料,应用引物搭桥法合成p15INK4B基因,应用基因工程的手段构建p15INK4B基因的原核表达载体,在E.coliRosetta(DE3)菌进行融合表达,并对表达产物进行亲和层析纯化。结果成功地构建了p15INK4B基因原核表达载体,经亲和层析制备了较高纯度的目的表达产物。

鸡p15因子抑制MDCC-MSB1细胞的增殖及端粒酶活性

为探讨鸡p15基因的生物学功能,试验构建了鸡p15基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-p15,并转染到鸡MDV转化的淋巴细胞系MDCC-MSB1,应用G418筛选掉未转染的细胞,对存活细胞p15蛋白的表达、细胞增殖力、群体倍增时间、细胞周期和端粒酶的活性进行了检测。结果表明,与转染空质粒pcDNA3.1(+)细胞相比,转染了p15基因的细胞稳定表达了p15蛋白;细胞的增殖受到了抑制,抑制率达45%～74%;群体倍增时间从27h延长至416h;流式细胞仪分析细胞周期发现,p15蛋白引起了细胞多停滞于G0/G1期,S和G2/M期细胞比例下降;端粒酶活性受到抑制。

二甲苯胺噻嗪对大鼠镇痛和麻醉的ED_(50)及时效的测定

大鼠腹腔注射二甲苯胺噻嗪（ｘｙｌａｚｉｎｅ）后，采用序贯法（ＳｅｑｕｅｎｔｉａｌＡｎａｌｙｓｉｓ）测定对大鼠镇痛和麻醉的半数有效量（Ｍｅｄｉａｎ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｄｏｓｅ，ＥＤ５０ ）。结果，镇痛的ＥＤ５０值１５．５２４ ｍ ｇ／ｋｇ 麻醉的ＥＤ５０ 值为４５．０９６ ｍ ｇ／ｋｇ，在增加一个公比（ｒ镇痛＝ １．５０７，ｒ麻醉＝ １．１４３）的基础上，我们取２５．０ ｍ ｇ／ｋｇ 和５５ ｍ ｇ／ｋｇ用于镇痛和麻醉实验，结果表明，镇痛组大鼠在给药后１５、３０、４５、６０ ｍ ｉｎ 时甩尾反射潜伏期（ＴＥＬ）升高４０％ 以上，与生理盐水组比较差异极显著（ｐ ＜ ０．０１），麻醉组大鼠的翻正反射消失率达１００％ 。

鸡p15^INK4B蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

用制备并纯化的鸡p15INK4B蛋白免疫BALB/c小鼠,制备了p15INK4B蛋白的单克隆抗体,并进行了鉴定。结果表明:2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C6和3F5分别属于IgG1和IgM抗体亚类;培养上清的效价分别为1∶820和1∶680,腹水的效价分别为1∶4×106和1∶7×105;2株单克隆抗体亲和力常数分别为3.13×109L/mol(1C6)和1.24×108L/mol(3F5),相对亲和力1C6>3F5,且具有不同的抗原识别位点;Western-blot鉴定表明,1C6和3F5这2株单克隆抗体均能与原核表达纯化的和杆状病毒表达的p15INK4B蛋白结合,而不与其他蛋白结合,说明本研究成功制备了鸡p15INK4B的单克隆抗体,可作为深入研究鸡p15INK4B蛋白的功能提供特异的抗体材料。

p15在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

为探讨鸡p15蛋白的特性及其在细胞周期抑制通路中与其他蛋白的作用,本研究选用昆虫细胞表达系统来表达有活性的p15蛋白。为后期纯化的需要,对pFAST供体质粒的多克隆位点进行了重新改造,并成功构建带有TAP纯化标签的供体质粒pFAST-NMCS-N-TAP-p15和pFAST-NMCS-C-TAP-p15。将2个供体质粒转化到DH10Bac感受态菌中,对阳性转化子Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15进行反复涂板的去阴性单克隆纯化,提取大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15并进行转座鉴定。将纯化的大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15转染入sf9昆虫细胞中,72h后收集培养上清中的杆状病毒,并进行病毒的扩增和滴度测定,结果所获2株重组杆状病毒N-TAP-p15和C-TAP-p15的滴度分别为3.6×107,5.4×107pfu/mL。将2株高滴度的重组杆状病毒再感染新培养的sf9昆虫细胞进行重组p15蛋白的表达,结果与对照组相比,重组p15融合蛋白得到了有效的表达,表达量分别为4.32%和4.7%。Western blotting结果表明,所表达的重组p15融合蛋白只特异地与p15单克隆抗体和兔的IgG反应而未与其他细胞蛋白反应;说明带有TAP标签的重组p15融合蛋白在昆虫细胞表达系统中得到了有效表达。

二甲苯胺噻嗪对大鼠血浆、下丘脑和垂体中β-内啡肽含量的影响

应用放射免疫学方法 ,检测腹腔注射二甲苯胺噻嗪后大鼠血浆、下丘脑和垂体中 β-内啡肽 (β- Ep)含量的变化 ,以研究二甲苯胺噻嗪对大鼠体内β- Ep的影响。结果 ,不同时间组与对照组相比 ,血浆在给药后 5 min即有统计学意义(P <0 .0 1) ,大约在 30 m in时达到最高峰 ,然后缓慢下降 ,其中麻醉组持续到给药后 12 0 min(P <0 .0 1) ,而镇痛组只持续到给药后 90 min。不同剂量组与对照组相比 ,下丘脑的 4mg/kg组无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,血浆的 4mg/kg组、垂体的 4mg/kg组差异有显著意义 (P <0 .0 5 ) ,其他组有极显著意义 (P <0 .0 1)。随着给药剂量的增加 ,组织内的β- Ep含量变化呈增加的趋势 ,这种趋势经相关分析表明 ,给药剂量在 4～ 6 0 mg/kg的范围内时 ,组织内的β- Ep含量与给药剂量呈正的直线相关关系 (r血浆 =0 .9748,r下丘脑 =0 .96 7,r垂体 =0 .977,均 P <0 .0 1)

潜伏期马立克氏病病鸡血清型病毒L-meq、meq基因的比较及遗传分析

从潜伏期感染马立克氏病病毒(MDV)鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得MDV的L-meq、meq基因,将其插入pMD18-T克隆载体,经测序并进行了序列分析。结果表明,L-meq、meq基因同源性很高,L-meq中只有180bp与meq不同。但是采用同样的方法在发病期病鸡淋巴组织中却只能获得MDV的meq基因。为了进一步研究发病期L-meq基因消失的原因,试验对L-meq、meq基因的氨基酸序列的结构域进行了分析。结果表明,L-meq基因中含有9个PRR(proline-rich-reapts)区域,meq中含有6个PRR区域,从而推断PRR区域可能与基因的转录激活及调控病毒DNA复制的功能有关,该180bp插入序列也许能解释初期感染MDV不致瘤的原因,同时也意味着L-meq基因对于潜伏期的维持是必要的。

人血管内皮生长因子和端粒酶催化亚基复合调控序列的构建及转录活性的研究

以人肝癌细胞基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增VEGF增强子和hTERT核心启动子序列,该序列与NCBI数据库参考序列相比,同源性达到99%以上。将VEGF增强子和hTERT核心启动子定向克隆到pBluescriptⅡSK载体中,构建VEGF增强子和hTERT核心启动子复合调控序列。酶切去除表达载体pECFP-C1的启动子CMV,并将所制备的复合调控序列连接到CMV位置,构建含该复合调控序列并可表达绿色荧光蛋白报告基因的重组质粒,转染人肺癌细胞和正常人肝细胞。结果显示,在人肺癌细胞中观察到绿色荧光,而在人肝细胞中没有检测到。由此说明,具有肿瘤特异性的VEGF增强子和hTERT核心启动子复合转录调控序列可以驱动绿色荧光蛋白基因在人肺癌细胞中表达,但不能驱动该蛋白在正常人肝细胞中表达。

小干扰RNA(siRNA)对马立克氏病淋巴瘤细胞chTERT基因表达的抑制

为通过体外转录的小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA)抑制马立克氏病淋巴瘤细胞(MDCC-MSB1)中鸡端粒酶反转录酶(Chicken telomerase reverse transcriptase,chTERT)mRNA的表达,探讨chTERT在MDCC-MSB1中的作用,本试验设计了针对chTERT mRNA的特异siRNA序列(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),利用T7 RNA聚合酶体外转录系统,制备21 bp的siRNA分子,通过脂质体介导转染MDCC-MSB1细胞,采用荧光实时相对定量RT-PCR方法检测转染细胞chTERT基因mRNA的相对表达量,流式细胞仪测定转染细胞周期变化情况。结果显示,siRNA-1和siRNA-3组在转染24 h后,有效地抑制了chTERT mRNA的表达,抑制率分别为68%和81%。细胞周期检测结果显示,与对照组相比,siRNA-1和siRNA-3转染组细胞在转染后24 h G0/G1期比例显著上升(P<0.05),S期比例显著下降(P<0.01),从而表明chTERT表达量的降低可有效抑制MDCC-MSB1细胞增殖。siRNA可有效抑制MDCC-MSB1细胞中chTERT基因的表达,而chTERT表达量的降低对MDCC-MSB1细胞增殖具有明显的抑制作用。

MDV中meq基因对CEF细胞chTERT,chTR表达影响的研究

利用TaqMan探针技术,采用实时荧光相对定量RT-PCR方法检测了MDV中meq基因对鸡胚成纤维细胞(CEF)的端粒酶催化亚单位基因(chTERT)、端粒酶RNA亚基(chTR)表达水平的影响,并用TRAP法测定了端粒酶活性,用流式细胞仪检测了细胞周期的变化.实验结果表明,转染48 h后chTERT表达水平为转染后72 h的16倍,chTR表达水平在转染前后基本不变;转染48 h后CEF细胞的相对端粒酶活性是转染72 h后的12倍;在转染后72 h S期细胞的百分比较未转染细胞显著增加.

鸡端粒酶RNA基因的克隆

本研究采用扩增条件优化的PCR扩增技术,以MDCC-MSB1细胞基因组DNA为模板扩增出鸡端粒酶RNA(chicken telomerase RNA,chTR)全长基因,克隆到pMD18-T载体中,经酶切鉴定和PCR鉴定后测定序列。序列分析表明所克隆的鸡端粒酶RNA基因全长465bp,其中模板区的11个核苷(5'-CUAACC-CUAAU-3')合成端粒亚单位(TTAGGG)n。chTR基因的克隆为进一步研究chTR在马立克氏病发病过程中的作用以及马立克氏病的发病机制提供可能的序列基础。

基于核酸i-motif结构的pH响应荧光传感器

利用核酸i-motif结构对质子的超敏感特性,选择富含胞嘧啶C的核酸链及其互补链,以及染料SYBR Green Ⅰ对单双链DNA的不同荧光响应特性,研制了一种灵敏的新型pH响应荧光传感器。当pH值从5.0变为7.5时,SYBR Green Ⅰ的荧光强度增大了4倍以上,pH传感范围是5.0～7.5,并显示出很高的pH分辨率(0.1个pH单元)。该pH传感器具有简单、快速、成本低等优点,有望用于相关生物过程中微小pH值变化的传感分析。

马立克病病毒中meq基因对CEF细胞chTERT mRNA转录水平的影响

目的研究鸡马立克病病毒(MDV)meq基因对鸡胚成纤维细胞(CEF)的端粒酶催化亚单位基因(chTERT) mRNA转录水平的影响,并探讨meq基因与端粒酶活性的关系。方法构建重组载体pcDNA-meq,转染CEF细胞,利用Taq- Man探针,经实时荧光定量RT-PCR检测meq基因对CEF细胞chTERT mRNA转录水平的影响,并用TRAP法测定端粒酶活性。结果meq基因能激活CEF细胞中chTERT mRNA的转录,在48h的转录水平是72h的16倍,端粒酶活性在转染后48h是转染后72h的12倍。结论meq基因可能是MDV基因组中的主要致瘤基因,可以在体外导入正常的CEF细胞中,激活端粒酶的活性。

HRE增强hTERT启动子-tk/GCV基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的杀伤作用

目的:探讨缺氧反应元件(HRE)增强hTERT启动子-tk/GCV逆转录病毒基因系统对缺氧环境肿瘤细胞的体外杀伤作用。方法:构建由HRE缺氧反应元件修饰的hTERT杂合启动子和hTERT单一启动子引导单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因表达的重组逆转录病毒载体,在脂质体介导下分别转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。将重组病毒感染人肺癌细胞SPC-A1和人肝癌细胞Bel-7402,G418筛选出抗性克隆肿瘤细胞。实验分为对照组、SPC-A1/tk组和Bel-7402/tk组。在缺氧处理条件下,MTT法检测前体药物丙氧鸟苷(GCV)对SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞的杀伤效应,流式细胞仪检测其细胞凋亡率和细胞周期的变化。结果:与对照组比较,缺氧环境培养的SPC-A1/tk和Bel-7402/tk细胞对GCV的敏感性明显增强,其中细胞凋亡率明显升高(P<0.001),细胞周期各期细胞数有所减少(P<0.05)。与hTERT启动子引导的tk基因系统组细胞比较,[HRE]hTERT杂合启动子引导的tk基因系统组肿瘤细胞存活率更低(P<0.01),诱导肿瘤细胞凋亡率明显升高(P<0.01),G1期和G0期细胞数有所增高(P<0.05),S期细胞数减少(P<0.05)。结论:HRE能增强hTERT启动子-tk/GCV自杀基因系统对缺氧环境中肿瘤细胞的体外杀伤作用。

hTERT核心启动子调控HSV-TK自杀基因系统诱导肿瘤细胞的凋亡

目的观察人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子调控逆转录病毒介导的单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统诱导肿瘤细胞凋亡的效果。方法采用PCR方法扩增胸苷激酶(TK)基因,并构建由hTERT核心启动子调控的胸苷激酶重组逆转录病毒载体pLNC-hTERTp-TK,转染包装细胞PT67,G418筛选阳性细胞克隆,检测病毒滴度,PCR法检测转染细胞中的TK基因。将获得的重组逆转录病毒感染人肺癌细胞株A549、肝癌细胞株SMMC-7721、宫颈癌细胞株HeLa和正常人成纤维细胞系WI-38,G418筛选阳性克隆,MTT法检测重组逆转录病毒对肿瘤细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡。结果重组逆转录病毒载体pLNC-hTERTp-TK经双酶切,可见1402bp的目的基因片段,表明质粒构建正确。从转染的PT67细胞中扩增出1131bp的基因片段,与TK基因大小一致。在成功转染重组逆转录病毒的PT67细胞中,病毒滴度最高者可达7.8×105CFU/ml。重组逆转录病毒感染的3种肿瘤细胞的增殖均受到抑制,且生长抑制率随着GCV浓度的增加而升高,经较低浓度GCV(10μg/ml)处理的3种肿瘤细胞,凋亡率分别可达37.06%、34.88%和33.59%。结论由hTERT启动子调控的逆转录病毒介导的HSV-TK/GCV自杀基因系统可诱导肿瘤细胞凋亡,且具有较强的特异性和高效性。

凋亡素原核表达及纯化

为进一步研究凋亡素结构与功能和制备凋亡素单克隆抗体,本试验构建了凋亡素的原核表达载体pET-28a-VP3,并将该质粒转化到大肠杆菌E.coliBL21中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白。结果证明在E.coliBL21中正确表达了凋亡素,同时对表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示在1.4 kD处出现目的蛋白带与预期相符。

唐醉石印谱知见录考

在整理唐醉石印谱过程中,笔者认为代表其印学成就的印谱应该成为研究的基点。本文梳理唐醉石印谱的现状,作为研究其印学价值的起点。作为“新浙派”印人的代表,唐醉石的印学体现出“合南北手为唐型”。理解“唐型”,绕不过对其印作、印谱的整体考量,借此窥视其印学思想的“唐型”。

玉米浸渍水制取肌醇的条件研究

为提高玉米淀粉生产过程中副产物浸渍水的利用,同时为肌醇的工业化生产提供参考,通过静态试验,对8种树脂(离子交换树脂412、D201、D301、D318、352、202、312、D201*4)进行筛选,确定树脂312为理想的试验树脂,并测定了树脂312对植酸根的吸附和解吸性能,结果性能较优;采用正交方法对玉米浸渍水的解吸液进行高温水解制取肌醇试验,最优条件为水解时间8小时、水解温度为160摄氏度和解吸液浓度20%。