马疱疹病毒1型ORF30基因原核表达载体的构建

马疱疹病毒1型(Equid herpesvirus 1,EHV-1)是引起孕马流产的主要病原体之一,也与死胎、新生幼驹死亡、青年马鼻肺炎以及一种名为马疱疹病毒性脑脊髓病(Equine herpesvirus myeloencephalopathy,EHM)的神经系统疾病有关。近些年来,EHM出现的频率越来越高,对养马业和赛马业的危害很大。最新研究结果显示,神经致病性毒株与编码病毒DNA聚合酶催化亚基的ORF30基因单核苷酸点突变有着很高的相关性。为了获得马疱疹病毒1型DNA聚合酶,并制备DNA聚合酶的多克隆抗体,本研究以EHV-1-XJ2015毒株基因组DNA为模板,扩增ORF30基因编码区,并连接于pMD19-T载体上,用BamHI和HindIII双酶切后,将酶切产物插入表达pET-28a(+)中,转化入大肠杆菌DH5感受态细胞,构建ORF30基因的原核表达载体pET-28a(+)-ORF30。通过酶切、PCR扩增和测序等方法对阳性重组质粒进行了鉴定。结果表明,构建的重组质粒pET-28a(+)-ORF30经BamhⅠ和HindⅢ双酶切后,经1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果与预期相符,表明目的片段成功插入载体pET28a(+)中。通过采用特异性引物对重组质粒pET28a(+)-ORF30进行PCR鉴定,产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察,得到一条大小约1074bp的清晰条带,与目的基因大小相符,表明重组质粒pET28a(+)-ORF30构建成功。本研究为进一步探讨马疱疹病毒1型ORF30基因遗传变异对DNA聚合酶功能的影响奠定了基础。