香叶木素对RSL3诱导小鼠精母细胞GC-2铁死亡的抑制作用及其机制

目的:探讨香叶木素(DIO)对谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)抑制剂(1S,3R)-RSL3(RSL3)诱导小鼠精母细胞GC-2铁死亡的抑制作用,并阐明相关作用机制。方法:GC-2细胞分为对照组、RSL3组、RSL3+0.8 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+4.0 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+铁死亡抑制剂Ferrostain-1(Fer-1)组(200 nmol·L^(-1)Fer-1)。分别采用0、1、5、10、50、100、500和1000 nmol·L^(-1)RSL3溶液及0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0和50.0μmol·L^(-1)DIO溶液处理细胞。另取GC-2细胞,分为空白组、模型组和给药组,给药组GC-2细胞按照处理方式分为0.8、4.0和20.0 nmol·L^(-1)DIO组及RSL3+0.8 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+4.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组。噻唑蓝(MTT)法检测各组GC-2细胞存活率。采用100 nmol·L^(-1)RSL3分别作用GC-2细胞0、6、12、24、36和48 h,Western blotting法检测各组GC-2细胞中铁死亡相关蛋白表达水平。试剂盒检测各组GC-2细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平及谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)比值,免疫荧光法观察各组GC-2细胞中酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)蛋白荧光强度。结果:MTT法检测,与0 nmol·L^(-1)RSL3组比较,50、100、500和1000 nmol·L^(-1)RSL3组GC-2细胞存活率均明显降低(P<0.01);与0μmol·L^(-1)DIO组比较,0.5、1.0、5.0、10.0和50.0μmol·L^(-1)DIO组GC-2细胞存活率均明显降低(P<0.01),后续实验中选择100 nmol·L^(-1)RSL3作用GC-2细胞,DIO作用浓度<0.1μmol·L^(-1)。与空白组比较,模型组GC-2细胞存活率明显降低(P<0.01);与模型组比较,RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组细胞存活率明显升高(P<0.01)。Western blotting法检测,与0 h比较,RSL3作用6 h时GC-2细胞中GPX4蛋白表达水平明显降低(P<0.01),RSL3作用12 h时GC-2细胞中HO-1蛋白表达水平明显升高(P<0.05),GPX4和FTH1蛋白表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),RSL3作用24 h时GC-2细胞中GPX4和HO-1蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01),RSL3作用36和48 h时GC-2细胞中HO-1蛋白表达水平均明显降低(P<0.01);将100 nmol·L^(-1)RSL3作用GC-2细胞12 h作为后续实验条件。与对照组比较,RSL3组GC-2细胞中MDA水平明显升高(P<0.01),SOD活性和GSH/GSSG比值均明显降低(P<0.05);与RSL3组比较,RSL3+0.8 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+4.0 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+Fer-1组GC-2细胞中SOD活性均明显升高(P<0.05或P<0.01),RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+Fer-1组GC-2细胞中MDA水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),RSL3+4.0 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+Fer-1组GC-2细胞中GSH/GSSG比值均明显升高(P<0.05或P<0.01)。免疫荧光法观察,与对照组比较,RSL3组GC-2细胞中ACSL4蛋白荧光强度明显增强;与RSL3组比较,RSL3+0.8 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+4.0 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+Fer-1组GC-2细胞中ACSL4蛋白荧光强度均明显减弱。Western blotting法检测,与对照组比较,RSL3组GC-2细胞中HO-1蛋白表达水平升高(P<0.05),GPX4和FTH1蛋白表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01);与RSL3组比较,RSL3+0.8 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+4.0 nmol·L^(-1)DIO组、RSL3+20.0 nmol·L^(-1)DIO组和RSL3+Fer-1组GC-2细胞中HO-1蛋白表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),GPX4和FTH1蛋白表达水平均明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论:DOI能够减轻RSL3诱导的小鼠精母细胞GC-2铁死亡,其机制可能与抑制HO-1蛋白表达,上调GPX4和FTH1蛋白表达有关。