顺铂诱导斑马鱼侧线毛细胞损伤及再生模型的建立

目的建立顺铂诱导斑马鱼侧线毛细胞损伤及再生模型。方法采用顺铂溶液直接孵育斑马鱼方法,通过免疫组化、荧光特异性标记侧线细胞的转基因鱼活体成像、原位杂交等方法统计分析顺铂处理前后斑马鱼侧线毛细胞剩余情况以及药物撤除后毛细胞再生情况。结果顺铂引起斑马鱼侧线毛细胞丢失具有剂量依赖效应,相同的孵育时间较高浓度的顺铂孵育后几乎可杀死全部侧线毛细胞;毛细胞再生与顺铂的毒性积累程度有关,较低浓度孵育较短时间毛细胞再生速度较快。毛细胞再生数目随着时间的延长不断增加,72小时后可再生原有数目的90%以上。结论斑马鱼侧线毛细胞经不同浓度顺铂孵育不同时间后,其毛细胞丢失与再生具有剂量和时间依赖效应。

顺铂引起斑马鱼侧线毛细胞凋亡的实验研究

目的探讨顺铂引起听觉毛细胞的死亡形式。方法利用模式脊椎动物斑马鱼侧线毛细胞易于处理和观察的优势,通过毛细胞特异性抗体免疫组化、活体染料、长时程活体成像、TUNEL染色以及Caspase-3原位抗体组化方法分别观察顺铂孵育过程中毛细胞形态变化、细胞核断裂情况以及Caspase-3活化情况,为顺铂引发听觉毛细胞的凋亡提供在体实验依据。结果与对照组相比,顺铂可引起斑马鱼侧线毛细胞90%丢失。长时程成像结果显示毛细胞在死亡过程中会出现逐渐固缩的现象。TUNEL染色结果表明顺铂可引起毛细胞细胞核断裂。Caspase-3抗体原位组化结果显示顺铂可导致毛细胞Caspase-3活化。结论通过细胞形态追踪、细胞核的断裂情况以及Caspase-3活化情况可得出结论顺铂通过细胞凋亡途径导致斑马鱼侧线毛细胞丢失。

Wnt/β-catenin信号通路对斑马鱼侧线毛细胞再生影响的实验研究

目的探讨Wnt/β-catenin信号通路对斑马鱼侧线毛细胞再生影响。方法利用模式动物斑马鱼侧线毛细胞可再生的优势,通过流式细胞分选助细胞类群、荧光定量PCR、整胚原位杂交以及外源添加Wnt/β-catenin信号通路小分子化合物抑制剂和增强剂的方法,观察顺铂诱导毛细胞损伤过程中Wnt/β-catenin信号通路各因子的时空表达情况及毛细胞再生情况变化,为探究经典信号因子Wnt/β-catenin信号通路对毛细胞再生的影响提供在体实验依据。结果反转录PCR(reverse transcription PCR,RTPCR)与定量PCR(quantitative PCR,Q-PCR)结果显示,与对照组相比,顺铂处理组Wnt/β-catenin信号通路配体wnt2,wnt3a和关键因子ctnnb1(beta-catenin)在助细胞类群中表达量升高(P<0.05)。整胚原位杂交结果表明Wnt/β-catenin信号通路拮抗因子dkk1a和dkk2在助细胞类群表达量下降。外源添加抑制剂,低浓度连续浸泡48小时再生毛细胞数目可达到正常组40%左右,高浓度连续浸泡48小时毛细胞再生数目仅为正常组10%左右。而在毛细胞再生前12小时时间窗添加抑制剂也可观察到毛细胞再生数目减少(P<0.0001)。外源添加增强剂,毛细胞再生数目相较对照组无显著变化(P>0.05)。结论通过分选助细胞各因子表达变化、整胚原位杂交显示时空图谱以及外源添加抑制剂与增强剂,得出结论Wnt/β-catenin信号对斑马鱼侧线毛细胞再生是必需非充分条件。

成纤维细胞生长因子21类似物对非酒精性脂肪性肝病斑马鱼模型疾病指征的改善情况

目的检测成纤维细胞生长因子21类似物对非酒精性脂肪性肝病斑马鱼模型的治疗效果。方法采用每日给予3倍正常饮食的方式喂养野生型斑马鱼建立非酒精性脂肪性肝病斑马鱼模型,外源给予终浓度为0.5μmol/L PF-05231023,20 d后检测其体长、体质量、体内甘油三酯等指标。肝脏组织切片HE染色评价病理学变化。定量PCR检测与脂质代谢、内质网应激及炎症等相关基因的表达变化。组间比较采用t检验进行统计学分析。结果QPCR和免疫荧光染色结果显示,成纤维细胞生长因子21在模型组斑马鱼高表达。加入成纤维细胞生长因子21类似物PF-05231023,显著降低模型组斑马鱼体长和体质量(P<0.01)、模型组体内甘油三酯的含量(P<0.05)。肝脏HE染色结果显示PF-05231023可以减轻模型组斑马鱼肝脏脂肪大泡和小泡等病变。定量PCR结果表明PF-05231023降低模型组脂质生成因子表达(P<0.01),增加脂质氧化相关因子表达(P<0.05)。PF-05231023降低模型组与炎症相关的因子表达(P<0.001)。PF-05231023降低模型组与内质网应激相关基因表达(P<0.05)。加入PF-05231023,可以减低油酸诱导HepG2细胞中的脂质和甘油三酯水平。结论加入FGF21类似物,可以改善非酒精性脂肪性肝病斑马鱼模型的疾病指征。

非酒精性脂肪性肝炎斑马鱼模型的建立

目的通过给予过量饮食的方法建立斑马鱼非酒精性脂肪性肝炎模型。方法采用每日给予3倍于正常饮食的方式喂养野生型斑马鱼，20d后检测其体长、体质量、体内甘油三酯等指标。用定量PCR检测与胆固醇代谢、脂质代谢、内质网应激及炎症等相关基因的表达变化。用肝脏组织切片HE染色评价病理学变化。组间比较采用t检验进行统计学分析。结果模型组斑马鱼体长（0．71±0．01）cm和体质量（44．83±1．83）mg高于对照组的体长（0．50±0．01）cm和体质量（19．33±2．75）mg（t体长=12．36，t体质量=7．71，P〈0．01），模型组体内三酰甘油的含量为（59．15±0．56）μmol／L，高于对照组的（16．71±0．36）μmol／L（t=63．84，P〈0．01）。定量PCR结果显示模型组与胆固醇合成相关基因表达高于对照组（P〈0．01）、模型组与脂质生成和脂质氧化相关因子表达量较对照组升高，两组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）、模型组与炎症相关的因子表达量也高于对照组（P〈0．01）、模型组与内质网应激相关基因表达高于对照组（P〈0．01）。肝脏HE染色结果显示模型组相较于对照组出现脂肪大泡和小泡等病理学改变。结论连续给予3倍于正常量的饮食20d，可在斑马鱼体内模拟人类非酒精性脂肪性肝炎的疾病特征。