NK细胞的高效扩增及其对体外肿瘤模型的杀伤效果研究

目的:高效扩增NK细胞,并确定其对不同肿瘤的杀伤作用,为临床应用提供参考。方法:从成人外周血中分离PBMCs并利用表面表达4-1BBL、IL-15和IL-21的K562滋养细胞对其进行共刺激培养,15 d后计数并检测CD3^-CD56^+细胞纯度;利用间接免疫荧光及Real-time PCR方法检测NK细胞Granzyme B及Perforin表达变化的同时检测其对肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌的杀伤作用,确定其对不同肿瘤的杀伤效果。结果:扩增15 d后,细胞数量高于110亿,CD3^-CD56^+比例达95%以上;培养后的NK细胞高表达Granzyme B、Perforin,且对A549的杀伤效果(E∶T=10∶1)约为90%,同时对其他肿瘤细胞(E∶T=10∶1)的杀伤效果由强到弱的顺序为:胃癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肾癌、肝癌(P<0.05);NK细胞对宫颈癌、肝癌、胰腺癌的杀伤效果呈现一定的时间依赖性。结论:此方法可以扩增出高数量、高纯度的NK细胞,同时该NK细胞具有高效杀伤多种肿瘤细胞的能力。

羊膜上皮细胞旁分泌特点及其在皮肤损伤修复中的作用

皮肤损伤修复是一个复杂而又高度协同的生物学过程,多种生长因子及白介素、趋化因子等细胞因子参与该过程,并调控皮肤愈合过程中创面的再上皮化、新血管生成以及细胞外基质沉积与重塑3个重要环节。人羊膜上皮细胞是一种类胚胎干细胞,广泛应用于创面损伤修复研究中。许多研究表明,人羊膜上皮细胞能够通过旁分泌作用促进皮肤创面的愈合。这些旁分泌因子不仅能够抑制创面微环境中细胞的凋亡,还能促进新血管生成和上皮再生。在此,本文综述人羊膜上皮细胞旁分泌特点,探讨人羊膜上皮细胞来源的旁分泌因子在创面愈合中的作用机制,并针对人羊膜上皮细胞或人羊膜上皮细胞来源细胞因子溶液应用于皮肤损伤治疗的未来可行性进行详细阐述。

超活化血小板裂解液和骨髓间充质干细胞联合应用对大鼠上颌快速扩弓后前腭缝骨改建影响的实验研究

目的研究超活化血小板裂解液(super-activated platelet lysate,sPL)、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)及二者联合应用对大鼠上颌快速扩弓后前腭缝骨改建的影响。方法16只6周龄雄性SD大鼠随机分为4组:对照组(A组);sPL注射组(B组);BMSCs注射组(C组);BMSCs+sPL注射组(D组)。建立大鼠上颌快速扩弓模型,扩弓7天后进入保持期,并按分组进行干预。保持21天后处死所有大鼠,通过MicroCT和组织学染色对前腭缝进行骨质分析和组织形态学观察。结果D组大鼠前腭缝宽度相比A组明显减小(P<0.05),骨小梁分离度(Tb.Sp)明显降低(P<0.01),骨小梁数目(Tb.N)明显增多(P<0.05),骨体积分数(BV/TV)显著高于A组和C组(P<0.05)。与A组大鼠相比,B组大鼠BV/TV增高,Tb.Sp降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。C组大鼠Micro-CT各项测量指标与A组相比无统计学差异(P>0.05)。组织学观察显示,B、C、D组大鼠前腭缝处骨改建较A组更活跃,D组大鼠单位骨小梁周长成骨细胞数明显高于A组和C组(P<0.05)。结论sPL单独应用或者BMSCs+sPL联合应用均能促进大鼠上颌快速扩弓后前腭缝骨改建,促进骨质形成。

二次贴壁法高效制备人脐带间充质干细胞

目的采用二次贴壁法高效制备人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)。方法将传统组织块贴壁法弃掉的脐带组织块转移至新的培养瓶中进行二次贴壁,分离hUC-MSCs,并用无血清培养体系连续传代,镜下观察细胞形态;分别检测不同代次细胞的增殖能力、细胞周期、免疫表型、多向分化能力。结果二次贴壁法分离的hUC-MSCs在第4天即出现细胞克隆,第8天汇合度可达70%,经过二次贴壁法,1根20 cm的脐带组织共获得P3间充质干细胞(MSCs)总数为1×10~9个。二次贴壁分离的细胞增殖能力旺盛,与一次贴壁获得的干细胞同代次平均倍增时间差异无统计学意义(P>0.05)。传统贴壁法与二次贴壁分离的细胞均表达超过98%的CD73、CD90、CD105和低于2%的CD34、CD45、CD14、CD79a、HLA-DR,且该细胞具有分化为成骨、成软骨和成脂能力。结论经无动物源培养体系体外扩增的二次贴壁分离方法可以获得大量具有MSCs生物学特性的hUC-MSCs,为其规模化临床应用奠定了基础。

二次贴壁法获得的人脐带间充质干细胞的体外安全性及其对1型糖尿病大鼠血糖的调节作用

目的探讨二次贴壁法获得的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的体外安全性及其对1型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)大鼠血糖的调节作用,为临床T1D的治疗提供实验依据。方法采用二次贴壁法从人脐带中进行多能干细胞的大规模培养,建立主细胞库(master cell bank,MCB)和工作细胞库(working cell bank,WCB),对干细胞的免疫表型、体外致瘤性、核型、端粒酶进行检测,以确定其体外安全性;通过干细胞体内移植试验初步分析其对T1D大鼠葡萄糖转化能力的影响。结果以1根20 cm脐带作为材料,经二次贴壁分离扩增后,建立MCB共250管(P3代)、WCB共250管(P5代),每管均4×10~6个hUCMSCs。MCB和WCB细胞均高表达CD73、CD90、CD105,低表达CD34、CD45、CD14、CD79a和HLA-DR;染色体稳定、无体外致瘤性。将WCB细胞取出复苏扩增1代后移植T1D大鼠,6周内,大鼠血糖水平较对照组(注射等量生理盐水)显著下降(P<0.05),且体重下降缓慢(P<0.05);6周后,与对照组相比,移植组大鼠胰岛组织形态明显恢复,肝脏合成葡萄糖转运蛋白能力提高。结论采用二次贴壁法获得的hUCMSCs所建立的MCB和WCB细胞生物特性一致,且具有良好的安全性。初步移植结果预示,T1D大鼠GLUT蛋白表达提高可能与hUCMSCs改善肝脏糖原合成能力有关。

人羊膜上皮细胞旁分泌作用及其对糖尿病大鼠创面血管再生的影响

目的研究人羊膜上皮细胞(human amnioticepithelial cells,hAECs)旁分泌情况及其在糖尿病皮肤损伤大鼠模型中皮肤愈合及血管再生的作用。方法采用流式细胞术对hAECs表型进行分析;ELISA方法检测hAECs培养上清中旁分泌因子含量;划痕试验检测hAECs条件培养基对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical veinendothelial cells,HUVECs)划痕的愈合作用,确定旁分泌作用对其迁移能力的影响;对糖尿病大鼠进行皮肤损伤造模,检测经h AECs治疗后,皮肤中CD34表达及Cyclin D1基因mRNA转录水平。结果 hAECs表面高表达间充质干细胞表面标志CD29、CD73、CD105及胚胎干细胞表面标志SSEA4,低表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90及造血干细胞表面标志CD45、CD34、HLA-DR;可大量分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),72 h时表达量显著高于24和48 h及培养基对照组(P <0. 05);HUVECs划痕后24和48 h,两种浓度条件培养基组对细胞的愈合作用均较基础培养基对照组强,差异有统计学意义(P <0. 01),且两种浓度条件培养基组细胞迁移率差异无统计学意义(P> 0. 05);hAECs治疗后糖尿病大鼠皮肤中CD34表达及Cyclin D1基因mRNA转录水平均显著高于相同取材时间条件下的未治疗组,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论 hAECs可大量分泌VEGF,并能够通过旁分泌作用促进体外HUVECs迁移、增殖及糖尿病大鼠皮肤血管再生。

结合人血小板裂解液培养人脐带间充质干细胞的基础培养基选择

目的结合人血小板裂解液(platelet lysate,PL)选取一种安全性高、成本低、适用于人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)生长,且在培养过程中不影响细胞各项功能的基础培养基,用于大量高代次hUC-MSC的培养。方法将MSCBM、α-MEM、IMDM 3种基础培养基分别与PL UltraGROG Advanced进行配比,培养P0~P8代hUC-MSCs,对比不同代次的细胞形态、扩增数量、增殖功能、分化功能及免疫表型,确定适用于HUC-MSCs培养的最佳基础培养基。结果3种培养基培养的P1~P5代细胞,形态均一,呈放射状生长,与标准的细胞形态相比差异无统计学意义(t_(IMDM VSα-MEM)=0.159,t_(MSCBM VSα-MEM)=0.147,t_(IMDM VS MSCBM)=0.161;P均>0.05),培养至P6~P8代时,MSCBM、α-MEM培养的细胞与P0~P5代细胞形态相比,差异无统计学意义(t_(IMDM VS MSCBM)=0.132,t_(IMDM VSα-MEM)=0.128;P均>0.05);MSCBM、α-MEM、IMDM培养的P1~P8代细胞阳性表达CD73、CD90、CD105,表达率均约达99%,阴性表达CD34、CD45,表达率均低于2%,不同培养基间差异无统计学意义(t_(IMDM VSα-MEM)=0.102,t_(MSCBM VSα-MEM)=0.106,t_(IMDM VS MSCBM)=0.113;P均>0.05);3种培养基培养的P8代细胞克隆形成性不同,MSCBM培养的细胞形成的单个克隆团和克隆团内细胞数量均高于α-MEM、IMDM培养的同代次细胞(t分别为0.023、0.049,P均<0.05);3种培养基培养的细胞增殖功能由高到低分别为MSCBM、α-MEM、IMDM,其中MSCBM显著高于IMDM(t=0.041,P<0.05),而与α-MEM差异无统计学意义(t=0.211,P>0.05),倍增时间(DT)与增殖功能结果一致;3种培养基培养的同代次细胞均具有较强分化功能,培养的P8代细胞分化成骨和成软骨的细胞数量无显著差异(t_(IMDM VSα-MEM=0.119,t_(MSCBM VSα-MEM)=0.112,t_(IMDM VS MSCBM)=0.111;P均>0.05),MSCBM培养的P8代细胞分化的成脂细胞数量高于α-MEM培养的P8代细胞(t=0.036,P<0.05),α-MEM培养的P8代细胞分化的成脂细胞数量高于IMDM培养的P8代细胞(t=0.031,P<0.05)。结论确定了最佳hUC-MSCs培养体系为MSMBM添加5%UltraGROG Advanced,其次为α-MEM添加5%UltraGROG Advanced,建议选择此两种无血清培养体系用于MSCs的大规模培养。