基于体外细胞实验和网络药理学探讨槐定碱治疗前列腺癌的作用机制

基于体外细胞实验、网络药理学和分子对接探讨槐定碱(sophoridine,SRI)对DU-145前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。MTT、克隆形成以及免疫荧光实验检测SRI对DU-145细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡情况。qPCR检测Ki67、PCNA、Caspase-3/7、Bcl-2、Bax以及p38MAPK mRNA表达。Western blot检测PCNA、Caspase-3、Bcl-2、Bax、p38MAPK以及p-p38MAPK蛋白表达。利用TCMSP、HERB、Swiss Target Prediction和PharmMapper数据库获得SRI靶点,利用OMIM、GeneCards数据库收集前列腺癌靶点,并通过Venny2.1.0筛选两者的共同靶点。利用STRING数据库构建蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络,采用Cytoscape3.9.0软件进行网络拓扑学分析以及PPI网络可视化。通过DAVID数据库进行GO富集和KEGG通路分析。采用AutoDock1.5.6软件进行分子对接。细胞实验结果表明SRI能显著抑制DU-145细胞的增殖,并促进其凋亡。PPI网络分析得到ALB、MAPK1、CASP3、MAPK8、p38MAPK等16个核心靶点。GO富集分析得到158个条目(P<0.01),主要集中在细胞凋亡过程、蛋白质磷酸化、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性等。KEGG富集分析得到84个信号通路(P<0.01),涉及癌症通路、癌症中的蛋白多糖、MAPK信号通路等。分子对接结果表明SRI与核心靶点p38MAPK能够稳定结合。qPCR和Western blot结果证实SRI能促进p38MAPK的表达。综上,本研究表明SRI能抑制DU-145前列腺癌细胞的增殖并促进其凋亡,这可能与p38MAPK的激活有关。

转基因大豆对雄性鼠生殖系统的安全性评估

以含转基因豆粕饲料喂食小鼠,观察对雄性小鼠生殖系统的影响。喂食小鼠120d后,通过PCR方法检测外源基因在睾丸中的存在情况;对睾丸组织制作石蜡切片,观察睾丸组织的病理损伤情况;通过流式细胞术检测睾丸组织中各生殖周期细胞比例;通过彗星电泳检测小鼠精子DNA损伤情况。结果表明:在睾丸组织中未检测到外源基因;睾丸组织切片未发现明显的病理学变化;试验组与对照组小鼠睾丸组织中各生殖周期精细胞比例无显著差异;未检测到精子DNA损伤。说明喂食转基因饲料对小鼠的生殖系统无显著影响。

抗草甘膦转基因大豆饲料对雄性小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响

以雄性昆明鼠为动物模型,对亲本(F0)和子一代(F1)短期(30 d)及长期(90 d)喂食抗草甘膦转基因大豆饲料后,取其脾脏,MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果表明:短期喂食实验过程中,在0、2、7、14和30 d取样时,转基因大豆饲料对亲本(F0)实验的雄性小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖均无显著性影响(P>0.05),在长期(90 d)喂食实验过程中,抗草甘膦转基因大豆饲料对亲本(F0)小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖也无显著影响(P>0.05)。同样,在30 d的短期和90 d的长期喂食实验过程中,抗草甘膦转基因大豆饲料对子一代(F1)雄性小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖也均无显著抑制作用(P>0.05)。表明短期(30 d)及长期(90 d)喂食含抗草甘膦转基因大豆饲料对亲本及子一代雄性小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖均无显著性影响,且无遗传积累效应。

喂食转基因大豆对子代雄鼠生殖系统的影响

亲代小鼠分别喂食转基因和非转基因大豆饲料,120 d后组内交配获得子一代小鼠。以转基因饲料喂食的亲代所繁殖的子代小鼠作为实验组,断乳后子鼠继续喂食转基因大豆饲料;对照组子鼠为亲代非转基因喂食组所繁殖,断乳后继续喂食非转基因大豆饲料。分别于喂食30、60、90、120 d取子代小鼠的睾丸称重并计算脏器系数,伊红法染色检测精子存活率与畸形率;制作石蜡切片HE染色后观察睾丸病理学变化。结果表明:与对照组相比,实验组小鼠睾丸系数、精子存活率与畸形率均无显著性差异;组织切片镜检未发现两组小鼠的睾丸出现明显病理损伤。实验结果说明转基因大豆饲料喂食120 d未对子代雄鼠精子质量和睾丸组织病理造成影响,表明亲代长期喂食转基因大豆饲料后无潜在遗传毒性及积累效应。

转基因大豆对雌鼠胚胎发育及受精能力的影响

为评估转基因大豆对雌鼠胚胎发育及受精能力的影响,用转基因大豆饲料（试验组）与非转基因大豆饲料（对照组）分别喂食雌鼠,30和90 d后分别检测观察动情周期变化规律及受精卵、2-细胞胚胎、囊胚在体内的发育情况。结果显示：试验组与对照组雌鼠动情周期均在4~5 d范围内,无显著差异;与对照组相比,试验组雌鼠体内受精的合子（受精卵、2-细胞胚胎、囊胚）数量、受精率、优胚率无显著性差异。研究结果表明：短期（30 d）和长期（90 d）喂食转基因大豆不会对雌鼠动情周期、受精能力及早期胚胎发育发生不良影响。

花生种子贮藏蛋白的氨基酸组成分析及发育过程中17.5 kDa多肽的合成规律

分析了两种不同蛋白质组成类型花生的子叶总蛋白３个主要组分及高甲硫氨酸类型花生的６０．５、４１、３８．５、１８和１７．５ ｋＤａ多肽的氨基酸组成，结果表明它们均含有 １７种氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸含量最高，而甲硫氨酸含量和半胱氨酸水平都极低。高甲硫氨酸类型品种的各组分的甲硫氨酸含量均显著高于低甲硫氨酸类型品种的对应组分的甲硫氨酸含量，在这两种类型花生中伴花生球蛋白ＩＩ都是甲硫氨酸含量最高的组分。探讨了１７．５ ｋＤａ高甲硫氨酸多肽在花生种子发育过程中的合成规律。

抗草甘膦转基因大豆对雄鼠睾丸的影响

以雄性昆明小鼠为动物模型,分别以抗草甘膦转基因大豆和非转基因大豆饲料喂食,于30、90 d后,取其睾丸.采用流式细胞术检测睾丸组织中各生殖周期细胞比例、Hoechst33258染色观察睾丸细胞凋亡、组织化学染色技术观察睾丸组织病理学变化.研究抗草甘膦转基因大豆对雄鼠睾丸的影响.结果显示,30、90 d实验组和对照组小鼠睾丸精细胞单倍体、2倍体、4倍体比例均正常且趋于稳定,单倍体比例占主导地位,且实验组与对照组相比无统计学差异.在荧光显微镜下实验组睾丸细胞的细胞核呈正常的蓝色,与对照组相比,未发现明显的细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染,颜色有些发白的凋亡细胞.组织病理观察也未发现两组小鼠的睾丸出现明显病理损伤.30 d喂食抗草甘膦转基因大豆急性毒理研究和90 d喂食抗草甘膦转基因大豆亚慢性毒理研究对雄鼠睾丸均无显著影响.

抗草甘膦转基因大豆粕对雄鼠运动机能的影响

在正常生理条件下,分别以抗草甘膦转基因大豆饲料和非转基因大豆饲料喂食雄性昆明小鼠,至30d检测其运动能力、耐疲劳能力和耐缺氧能力,探讨抗草甘膦转基因大豆对雄鼠运动机能的影响。同时以环磷酰胺处理建立小鼠病理模型,探讨病理条件下抗草甘膦转基因大豆对雄鼠运动能力、耐疲劳能力和耐缺氧能力的作用。结果显示,在正常生理条件下,与非转基因对照组相比,喂食30 d抗草甘膦转基因大豆饲料组雄鼠的运动能力、耐疲劳能力和耐缺氧能力均无统计学差异(P>0.05);同样,在环磷酰胺诱导的病理条件下,喂食抗草甘膦转基因大豆饲料30 d也不会对雄鼠运动能力、耐疲劳能力和耐缺氧能力造成不良影响。结果表明,喂食抗草甘膦转基因大豆饲料30 d对雄鼠运动机能无毒性效应。

花生种子贮藏蛋白的热稳定性与氨基酸组成的关系

分析两种不同蛋白类型的花生种子贮藏蛋白热稳定性 ,表明各品种类型花生种子贮藏蛋白的 3种主要组分的的热稳定性存在显著的差异 ,即伴花生球蛋白 热稳定性最高 ,伴花生球蛋白 次之 ,花生球蛋白最低。高甲硫氨酸品种类型 (汕油 5 2 3)的贮藏蛋白中无论花生球蛋白还是伴花生球蛋白 的热稳定性都高于低甲硫氨酸品种类型 (海花 1号 )相应组分的热稳定性。氨基酸分析表明 ,各品种 3种组分中 17种氨基酸中的大多数氨基酸含量无显著变化 ,并且天冬氨酸 ,谷氨酸和精氨酸的含量最高 ,三者之和可达总量的 45 %以上 :3种组分中 ,伴花生球蛋白 除了谷氨酸和精氨酸含量显著高于花生球蛋白 ,伴花生球蛋白 外 ,含硫氨基酸 (甲硫氨酸和半胱氨酸 )也明显高于后两者。 3个组分中含硫氨基酸水平与热稳定性正相关 ,即含硫氨基酸水平越高 ,其热稳定性越高。冷藏过程中含硫氨基酸高的伴花生球蛋白 不易降解、保持高热稳定性水平。

抗草甘膦转基因大豆对雄鼠睾丸生殖细胞与精子的影响

以雄性昆明鼠为实验动物,新生小鼠断乳后喂食抗草甘膦转基因大豆饲料,分别在30、60、90、120d取其睾丸和附睾,采用吉姆萨染色(Giemsa)检测小鼠睾丸组织早期精细胞微核率变化,并以荧光素标记的豌豆凝集素(FITC-PSA)检测小鼠附睾精子顶体完整率及顶体反应率变化。结果表明:与对照组相比,30、60、90、120d喂食抗草甘膦转基因大豆对小鼠睾丸组织早期精细胞微核率均无统计学差异,与之对应,30、60、90、120d喂食抗草甘膦转基因大豆对小鼠精子顶体完整率及反应率也无显著变化。研究表明:转基因大豆饲料30、60、90、120d喂食不会对小鼠睾丸组织染色体结构造成损伤,也未对小鼠精子的顶体形态结构和精子顶体反应能力造成影响。

两种不同蛋白质组成类型的花生种子甲硫氨酸含量的比较分析

本文对两种不同蛋白质组成类型花生的子叶总蛋白 3个主要组分 ,花生球蛋白、伴花生球蛋白 和伴花生球蛋白 进行了部分纯化 ,并进行了氨基酸分析。它们的氨基酸组成研究表明 ,这两种类型花生的子叶总蛋白中及其 3个主要组分均含有 1 7种氨基酸 ,包括 8种必需氨基酸 ,其中天冬氨酸、谷氨酸和精氨酚含量为最高 ,约为总量的 45 % :而甲硫氨酸含量和半胱氨酸水平都极低。在这 3个主要组分中 ,花生球蛋白的甲硫氨酸含量最低 ,伴花生球蛋白 次之 ,伴花生球蛋白 最高。高甲硫氨酸类型品种 (汕油 5 2 3)其花生球蛋白、伴花生球蛋白 和伴花生球蛋白 的甲硫氨酸含量均显著高于海花

花生种子贮藏蛋白发育和萌发过程中17.5×10~3多肽的合成降解规律

目的 :分析花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和伴花生球蛋白Ⅱ及其组成多肽的氨基酸组成 ,筛选高甲硫氨酸多肽并研究其在花生种子发育和萌发过程中的合成降解规律 方法 :花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和Ⅱ经SephadexG - 10 0纯化后 ,再以制备电泳和电泳洗脱得到高纯度的 5种多肽 ;酸水解法测定了花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和Ⅱ以及 5种多肽的氨基酸组成 ;WesternBlot分析了种子发育和萌发过程中 17 5× 10 3多肽的合成降解规律 结果 :花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和Ⅱ以及 5种多肽均含有 17种氨基酸 (包括 8种必需氨基酸 ) ,其中天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸含量为最高 ,约为总量的 4 5% ;而甲硫氨酸含量水平都极低 在这 5种多肽中 ,17 5× 10 3多肽的甲硫氨酸含量最高 17 5× 10 3多肽在花生种子发育早期开始合成 ,而在种子吸涨 60h时发生降解 结论 :17 5× 10 3多肽的甲硫氨酸含量最高 。

广州市农贸市场中转基因大豆的检测

对广州市农贸市场中销售的大豆进行转基因大豆的初步筛查,以检测在广州市场是否有转基因大豆流通和销售,为相关标识和监管提供实验依据。根据转基因大豆内参凝集素Lectin基因及外源基因CaMV35S、NOS及EPSPS基因序列设计4对引物,对收集的大豆样品提取其基因组DNA后进行PCR检测。结果在所收集的14份大豆样品中检测出1份转基因大豆,表明在广州农贸市场中存在转基因大豆,并在市场流通,提醒相关部门需根据国家规定需要加强监管力度。

广东分离株HPV16型L2与重组E7融合蛋白原核表达载体的构建

分析广东分离株HPV16型的L2和E7基因结构,并对E7的4个功能区重新排列组合形成失去致癌作用但其抗原表位不改变,其命名为rE7,构建pET-28a-L2、pET-28a-rE7、pET-28a-L2-rE7、pET-28a-rE7-L24个原核表达质粒.采用PCR技术从广东分离株HPV16基因组中扩增L2基因;用重叠PCR技术人工合成rE7基因和L2-rE7、rE7-L2融合基因,并构建到原核表达载体pET-28a(+)上.成功扩增广东分离株HPV16型L2基因,经重叠PCR技术成功得到rE7、L2-rE7和rE7-L2基因并成功构建了原核表达的4个载体:pET-28a-L2、pET-28a-rE7、pET-28a-L2-rE7、pET-28a-rE7-L2.广东分离株HPV16型L2基因与中国标准株有9处不同,同源性为99.37%,其编码氨基酸序列有8处突变.成功合成失去致癌作用的基因rE7及构建4个原核表达载体.

重叠PCR合成HPV16 E6、E7基因并构建植物表达双元载体

HPV16型为主的多种HPV病毒可诱发机体发生宫颈癌等疾病,以重叠PCR法人工合成HPV16 E6、E7致癌基因的融合基因,以之为目的基因构建了无选择标记基因(Marker-Free)双元载体,期望转化番茄开发新型宫颈癌治疗性疫苗-转基因植物口服疫苗。通过生物信息学分析HPV16 E6、E7基因,设计并合成密码子优化的靶基因E6-E7融合基因;并在目的基因的上游引入分子佐剂LTB基因,与Kozak序列等表达元件相偶联,以提高目的基因在植物表达系统的表达水平、增强其诱导黏膜免疫的免疫原性。目前已构建pX6-LTB-E7和pX6-LTB-E7-E6两个番茄转化双元载体。采用番茄Marker-Free系统转化和表达HPV16 E6、E7目的基因可以在转化后代中剔除标记基因,从而消除由标记基因可能引起的转基因植物口服疫苗的安全性问题,为HPV转基因植物口服疫苗应用奠定基础。

植物化的猪α-乳清蛋白基因人工合成

根据猪α-乳清蛋白基因 c DNA序列设计了多对特异性引物 ,采用循环 PCR方法人工合成了植物化的猪α-乳清蛋白基因编码区 (398bp)并对该 PCR产物进行测序。DNA序列测定结果表明 ,采用循环 PCR法扩增的产物是预期的猪 α-乳清蛋白基因编码区 ,该植物化的猪 α-乳清蛋白基因编码区可以用于植物转化 ,为猪 α-乳清蛋白基因转基因植物研究和在转基因植物中进行动物基因表达研究奠定了基础。

酒精对丙酸睾酮诱导的小鼠前列腺增生的作用

目的:探讨酒精对丙酸睾酮引起的小鼠前列腺增生(BPH)的作用及其生殖毒性。方法:成年雄性昆明系小鼠70只随机分为空白对照组(Control)、阴性对照组(Negative control,sc大豆油25 mg/(kg·d),ig蒸馏水7.5ml/(kg·d),连续处理7 d、21 d)、酒精7 d和21 d组(AL7和AL21,ig 50°白酒7.5 ml/(kg·d),连续处理7 d、21d),丙酸睾酮7 d和21 d组(TP7和TP21,sc丙酸睾酮注射液25 mg/(kg·d),连续处理7 d、21 d),丙酸睾酮+酒精7 d组(TP+AL7,sc丙酸睾酮注射液25 mg/(kg·d),ig50°白酒7.5 ml/(kg·d),连续处理7 d),每组10只。末次处理24 h后处死小鼠,计算小鼠前列腺和睾丸系数,检测精子参数,测定睾丸和前列腺组织中自由基水平、抗氧化能力,观察前列腺组织病理学变化。结果:与对照组、TP7 d组、AL7和AL21 d组相比,TP+AL7 d组的前列腺系数显著提高、精子数量和质量显著降低、前列腺和睾丸MDA含量显著升高、SOD和GPx酶活力显著下降(P均<0.05);与TP21 d组相比,TP+AL7 d组的前列腺系数无显著差别(P>0.05))。结论:丙酸睾酮和酒精共同处理7 d就可以达到典型的前列腺增生(BPH)状态,并引起睾丸及精子的损伤,导致生殖系统的氧化应激反应增强,说明酒精对丙酸睾酮引起的小鼠前列腺增生有明显的促进作用。

转基因拟南芥中外源基因的Southern blot检测

外源基因在转基因植物的稳定表达是获得理想转基因植物的首要条件。在我们进行的转基因植物研究中,根据转基因植物所带有的转基因成分和标记基因的DNA序列,采用Southern blot技术对转基因植物中的猪α-乳清蛋白基因和标记基因的拷贝数进行了分析。结果表明:外源基因的拷贝数和外源基因的稳定表达相关。

人工合成的植物化猪α乳清蛋白基因在转基因拟兰芥的表达(英文)

将一个398 bp的植物化的猪α乳清蛋白基因(Lactalbumin, LA)编码区克隆到带有花椰菜花叶病毒的35S启动子的质粒中。对它们进行PCR检测和序列分析,证实这些阳性克隆是实验预期的重组质粒。随即将35S启动子- α-乳清蛋白基因-终止子这一表达单元克隆到双元载体pCG-CB中,用该重组质粒双元载体pCG-CB-Lact转化农杆菌V3101后,以农杆菌法进行拟兰芥植物转化,用除草剂Finale对转化植物进行抗除草剂基因筛选,得到一些抗除草剂的转化植株。对这些抗除草剂植株进行猪α乳清蛋白基因PCR分析,成功筛选到带有猪α乳清蛋白基因并且可以在后代稳定遗传的转基因植物。Western blot蛋白质表达分析,表明猪α乳清蛋白在拟兰芥中成功表达,并且猪α乳清蛋白被正确加工成天然蛋白。

密码子植物化的小鼠ZP3蛋白基因人工合成

对小鼠ZP 3蛋白基因cDNA序列进行生物信息学分析,并将其核心区分成两部分进行分部合成。设计了多对特异性的重叠引物,采用多步PCR方法合成了植物化的小鼠ZP 3蛋白基因的不同片段。再经重叠PCR技术将这两段DNA连接在一起,构成完整的ZP 3基因的编码区。DNA序列测定人工合成的基因为植物化的ZP 3基因。