毒害艾美耳球虫配子体抗原EnGAM22单克隆抗体的制备与鉴定

旨在制备毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)配子体抗原EnGAM22单克隆抗体,用Ni-NTA亲和层析纯化的重组抗原rEnGAM22免疫BALB/c小鼠,免疫3次后,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用预先建立的ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行4次亚克隆后,获得2株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株并命名为2F3和3D3;对单抗亚类和特异性进行鉴定,应用单抗识别天然蛋白和虫体定位。结果显示,单克隆抗体2F3和3D3亚类分别为IgG2a、IgG2b,纯化后腹水效价分别为1∶256000、1∶64000,能特异性识别重组抗原rEnGAM22和毒害艾美耳球虫天然配子体蛋白;免疫荧光定位显示单克隆抗体2F3和3D3能特异性识别大配子体的成壁体和卵囊壁,表明EnGAM22抗原参与卵囊壁的形成。制备的单克隆抗体为研究球虫卵囊壁形成的分子机制奠定了基础。

毒害艾美耳球虫钙调素依赖性蛋白激酶基因的原核表达及其在不同发育阶段的表达分析

在前期分析比较毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子和配子体的转录组时,发现基因代号为ENH00078000的钙调素依赖性蛋白激酶(CaMK)基因呈差异表达。为了研究毒害艾美耳球虫钙调素依赖性蛋白激酶(EnCaMK)的功能,研究首先人工合成了该基因,构建pET-28a-EnCaMK表达载体,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,并进一步分析EnCaMK在毒害艾美耳球虫第二、三代裂殖子和配子体中的表达情况。结果显示:重组蛋白大小为48 ku左右,以包涵体形式为多,能被组氨酸(His)单克隆抗体特异性识别和鸡抗毒害艾美耳球虫多克抗隆抗体血清识别;用抗重组蛋白的鼠多克隆抗体在第三代裂殖子和配子体蛋白中检测到35 ku左右的EnCaMK条带,且在第三代裂殖子中表达量较高,显示差异表达。研究结果为进一步研究EnCaMK的酶活性与功能奠定了基础。

鸡球虫体外细胞培养的研究进展

球虫的细胞培养是指在体外合适的细胞体系中培养球虫完成其发育过程的方法,该方法经过近50年的发展已逐步形成一种比较完备的体外培养技术,目前该技术已在球虫学研究中广泛应用。作者从鸡球虫体外培养的球虫种类及其发育阶段、细胞类型、影响因素及其应用等4个方面对这一技术研究作一简要综述。

弓形虫ChineseⅠ型虫株试验感染仔猪组织病理学观察及虫体动态分布

为研究弓形虫ChineseⅠ型虫株感染仔猪的组织病理变化及虫体动态分布,本研究将YZ-1株速殖子通过静脉注射的方法感染仔猪,于感染后第10、25、50、80天,采集不同组织脏器,制作组织病理切片观察病理变化,并提取各组织器官的基因组DNA分别进行弓形虫529 bp重复序列及B1基因的PCR检测。结果显示,弓形虫急性感染可引起仔猪发病和死亡,病变主要发生在肺脏、肝脏、脾脏和淋巴结等组织,慢性感染病变则主要表现在脑和肺脏;弓形虫感染后第10天,感染仔猪21个主要组织脏器均能检测到弓形虫特异性基因,随着感染时间的延长,虫体分布的组织数量逐渐减少,其中脑、肺脏和肾脏持续时间最长,显示为弓形虫最主要的靶器官,至感染后第80天,所有组织脏器均未再检测到弓形虫特异性基因。研究结果揭示了弓形虫ChineseⅠ型株诱导仔猪的组织病理学特征及虫体动态分布,为猪弓形虫病的临床病理和分子诊断提供了理论依据。

柔嫩艾美耳球虫3种重组配子体蛋白免疫雏鸡的抗球虫免疫保护效果

将柔嫩艾美耳球虫重组配子体蛋白rEtGAM22、rEtGAM56和rEtGAM59分别单独免疫(单免)或联合免疫(联免)雏鸡,同时设未免疫攻虫组和空白对照组为对照,分别用柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫进行攻虫试验,以存活率、排出血便数、平均增重、相对增重率、病变记分、卵囊减少率、抗球虫指数和血清特异性抗体水平为指标来评价这3种重组蛋白免疫雏鸡的抗球虫免疫保护效果。结果显示:各试验组的成活率均为100%。与空白对照组比较,各免疫组鸡排血便堆数减少、平均增重显著(P<0.05)增加;用柔嫩艾美耳球虫攻虫后,rEtGAM22与rEtGAM59联免组相对增重率(86.71%)最高,rEtGAM59单免组平均病变记分最低、卵囊减少率(59.61%)最高,rEtGAM22与rEtGAM59联免组抗球虫指数值(163.71)最高。用毒害艾美耳球虫攻虫后,rEtGAM22与rEtGAM59联免组相对增重率(83.06%)最高,rEtGAM56与rEtGAM59联免组平均病变记分最低,rEtGAM56单免组卵囊减少率(66.97%)最高,rEtGAM56与rEtGAM59联免组抗球虫指数(158.23)最高。各免疫组血清特异性抗体水平均显著(P<0.05)高于空白对照组,其中rEtGAM56单免组血清特异性抗体水平最高,且显著(P<0.05)高于其他免疫组。结论:rEtGAM59单免或与rEtGAM22联免的抗柔嫩艾美耳球虫的保护效果较好,rEtGAM56单免或与rEtGAM59联免的抗毒害艾美耳球虫的保护效果较好。

扬州市流浪犬肠道寄生虫种类的调查

为了解扬州市流浪犬肠道寄生虫的感染情况,采取离心沉淀法和饱和食盐水漂浮法分别对62份犬粪便样品进行检查。结果显示：共发现4种犬肠道寄生虫,分别是犬弓首蛔虫、钩口线虫、类圆线虫和犬等孢球虫,其感染率分别为30.65%、8.06%、3.23%和11.29%,寄生虫总感染率为48.39%;犬弓首蛔虫为优势种。混合感染2种寄生虫2例,混合感染3种寄生虫1例,混合感染率为4.84%。

猪ARAF基因真核表达及其对PK15细胞凋亡的调控作用

为研究猪ARAF(v-raf murine sarcoma 3611 viral oncogene homo)lo基g因在PK15细胞的表达、定位及其对细胞凋亡的调控作用,本文以PK15细胞为研究对象,RT-PCR扩增猪ARAF基因CDS序列,经TA克隆至载体pGEM-T-Easy,随后加酶切位点和保护性碱基设计引物,PCR扩增后,构建重组真核表达载体pc DNA3.1-EGFP-ARAF,重组载体经脂质体法转染PK15细胞,荧光显微镜观察转染效果,qPCR与Westernblot分别检测A R A F基因mRNA和蛋白表达水平,间接免疫荧光试验观察猪A R A F的亚细胞定位;同时,流式细胞术及免疫印迹试验探究ARAF对PK15细胞凋亡的影响。结果显示,构建的重组真核表达载体转染成功,荧光显微镜检查可见转染组和空载组细胞均表达绿色荧光蛋白。转染组细胞ARAF基因mRNA及蛋白表达量较空载组和空白对照组显著升高(P<0.01)。激光共聚焦显微镜观察到该基因表达蛋白主要定位于PK15细胞胞质中。流式细胞术及免疫印迹试验检测时可见转染组PK15细胞凋亡率显著增加;相较空载组和空白对照组,转染组细胞中凋亡相关蛋白BAD(B-cell lymphoma-2 antagonist of cell d)e、aBtchl-2(B-cell lymphoma-2)蛋白的表达量无显著性变化,而BAX(B-cell lymphoma-2 associated)X、Cleaved caspase-3的蛋白表达量显著升高(P<0.01),显示高表达ARAF基因可促进PK15细胞的凋亡。上述研究结果为进一步深入探讨ARAF基因对PK15细胞凋亡的调控机制研究奠定了重要基础。