肥胖2型糖尿病导致小鼠睾丸生精功能障碍的研究

目的探讨高脂饮食诱导的肥胖2型糖尿病对小鼠生殖功能的影响。方法将16只C57BL/6J小鼠按照体质量梯度抽样法分为对照组(n=8)和实验组(n=8),对照组小鼠喂养标准饮食16周,实验组小鼠饲喂高脂饮食16周,通过检测体质量、口服葡萄糖耐量试验(OGTT)、胰岛素耐受试验(ITT)、精子参数等相关指标,HE染色观察组织形态,Western blot检测自噬相关蛋白水平等来探究高脂饮食对肥胖2型糖尿病小鼠睾丸形态及生精功能的影响。结果通过高脂饮食诱导16周后,小鼠体质量增加,葡萄糖耐量异常,胰岛素敏感性降低,且精子数量减少,活力降低,睾丸形态及生精细胞功能异常,自噬蛋白增加。结论高脂饮食诱导的肥胖2型糖尿病,可导致小鼠睾丸形态异常及生精功能障碍,可能与过度自噬相关。

卵巢细胞系糖脂代谢紊乱模型的构建及机制探索

目的通过在培养基中加入葡萄糖及油酸,模拟糖脂代谢紊乱时体内高糖高油酸微环境,建立中国仓鼠卵巢(CHO)细胞代谢紊乱模型并探究作用机制。方法培养卵巢细胞系CHO细胞,将细胞分为4组:对照组(C组)、单独高油酸模型组(O组)、单独高糖模型组(G组)、高糖高油酸联合模型组(GO组),采用25 mmol·L^(-1)的葡萄糖与62.5μmol·L^(-1)的油酸,分别诱导不同时长,选择最佳处理时间和药物处理方式,建立细胞模型,通过CCK-8检测细胞增殖水平,倒置显微镜观察模型细胞形态变化,Western blot、免疫荧光染色等方式检测半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达,通过磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)以及磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的蛋白表达,初步探索其机制。结果HE染色可见,与C组相比,O组、G组和GO组细胞数量均减少(P均<0.05),且细胞形态由长梭形皱缩变圆;CCK-8结果显示,高糖高油酸联合处理24 h细胞增殖水平变化最明显,且与C组相比,O组、G组和GO组在24 h时细胞增殖率均下降(P均<0.05);对细胞蛋白进行Western blot实验,与C组相比,O组、G组和GO组CHO细胞Caspase-3蛋白表达增加,G组及GO组PCNA蛋白表达减少(P均<0.05)。细胞免疫荧光染色结果亦显示,与C组相比,GO组细胞Caspase-3的表达增加(P<0.05),PCNA表达降低(P<0.05)。与C组相比,O组、G组及GO组CHO细胞中p-AMPK蛋白表达减少,G组p-mTOR蛋白表达增加(P均<0.05)。结论给予CHO细胞高油酸、高糖和高糖高油酸联合处理均可以导致细胞处于代谢紊乱微环境,并用作研究糖脂代谢紊乱对CHO细胞作用的体外模型。

益脾补肾方改善肥胖2型糖尿病小鼠生精功能障碍作用及机制

目的观察益脾补肾方改善肥胖2型糖尿病小鼠生精功能障碍的作用,并探讨其作用机制。方法将30只4周龄健康C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组、模型组、益脾补肾方低剂量组(低剂量组)、益脾补肾方高剂量组(高剂量组)、二甲双胍组,每组6只。对照组给予普通饲料,其余各组给予高脂饲料喂养16周,建立肥胖2型糖尿病小鼠模型。低、高剂量组给予益脾补肾方2、4 g/(kg·d),二甲双胍组给予二甲双胍200 mg/(kg·d)灌胃,模型组和对照组灌胃等量的生理盐水,连续灌胃30天。干预前后进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素耐量试验(ITT),计算曲线下面积(AUC);观察睾丸形态,测量小鼠重量并计算睾丸脏体比;HE染色观察睾丸形态变化;检测精子参数以及空腹血糖(FBG);ELISA法检测血清中睾酮(T)水平;比色法检测血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的变化;Western Blot检测脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)表达。结果对照组小鼠睾丸组织结构清晰,生精小管内各级生精细胞排列整齐;模型组小鼠睾丸组织结构混乱,各级生精细胞排列混乱,且数量显著减少,腔内出现大面积空洞;干预组出现不同程度改善。与对照组比较,模型组体重、体重AUC、FBG、OGTT-AUC、ITT-AUC、精子畸形率、血清MDA水平增加(P<0.05,P<0.01),睾丸系数、附睾系数、精囊腺系数、精子数量、精子活力、精子活率、血清T、血清T-SOD、GSH-Px水平、睾丸PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。与模型组同期比较,干预组体重AUC、体重、OGTT-AUC、ITT-AUC、精子畸形率、血清MDA水平下降(P<0.05,P<0.01),睾丸系数、附睾系数、精囊腺系数、精子数量、精子活力、血清T-SOD、GSH-Px水平、睾丸Bcl-2蛋白表达增加(P<0.05);二甲双胍组精子活率、血清T、睾丸PI3K表达增加(P<0.05);低剂量组睾丸p-Akt蛋白表达升高(P<0.05);高剂量组精子活率、血清T、睾丸PI3K、p-Akt蛋白增加(P<0.05)。与二甲双胍组同期比较,低剂量组干预后体重AUC、体重增加(P<0.05);高剂量组干预后体重AUC、精子活力、血清T增加(P<0.05),ITT-AUC降低(P<0.05)。结论益脾补肾方可能通过调节PI3K/Akt/Bcl-2通路调节糖代谢来改善肥胖2型糖尿病小鼠生精功能。

二甲双胍改善多囊卵巢综合征并激活雌性生殖干细胞

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是生育年龄妇女常见的一种复杂的内分泌及代谢异常所致的疾病,是女性不孕的重要因素。二甲双胍是临床应用最广泛的经典口服降糖药物,近年来被应用于PCOS治疗,但其作用机制尚不明确。本研究通过建立小鼠PCOS模型,论证二甲双胍对PCOS的改善作用及其机制。4~5周龄雌性C57BL/6J小鼠连续21天给予来曲唑(每天灌胃1 mg/kg)联合高脂饮食,建立PCOS模型。成模后灌胃给予二甲双胍(每天200 mg/kg),1个月后取材,期间检测体重并进行糖耐量试验。取材后行苏木素-伊红(H&E)染色检测卵巢病理改变;ELISA法测定血清中抗缪勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(E_(2))、睾酮等激素水平;免疫组织化学及免疫荧光染色法检测雌性生殖干细胞(female germline stem cells,FGSCs)标志物DDX4/MVH及PCNA表达及定位;Western blot检测小鼠卵巢中DDX4/MVH、PCNA、cyclin D2以及AMPK/mTOR通路蛋白。结果显示,PCOS小鼠在接受二甲双胍治疗后,体重逐渐恢复正常,糖耐量试验显示糖耐量明显改善,血清E 2水平升高,AMH、LH、睾酮水平及LH/FSH比值下降,卵巢多囊病变减轻,闭锁卵泡减少,且具有增殖性的FGSCs数目明显增多,卵巢组织PCNA、cyclin D2等增殖相关蛋白增加,p-mTOR、p-AMPK等蛋白明显上调。以上结果提示,二甲双胍在改善PCOS高雄激素血症、糖耐量异常及卵巢多囊病变的同时,还可以促进FGSCs增殖并激活其功能,其作用可能与AMPK、mTOR磷酸化有关。这些发现为二甲双胍治疗PCOS以及改善卵泡发育提供了新的科学依据和方向。