双靶点抗乳腺癌融合蛋白Del1-9-G129R-endostatin真核表达载体的设计构建

目的:构建双靶点抗乳腺癌融合蛋白Del1-9-G129R-endostatin的真核表达载体。方法:以质粒pET22b(+)Del1-9-G129R-hPRL为模板,PCR扩增首尾端带有HindⅢ和BamHI识别序列的目的基因Del1-9-G129R-hPRL,用于融合基因合成,同时扩增首尾端带有HindⅢ和KpnI的单基因作为对照。提取人肝脏总RNA,利用RT-PCR技术扩增两端带有BamHI、KpnI以及HindⅢ、KpnI识别序列的目的DNA片段Endostatin,分别用于融合基因合成和单基因对照。采用重叠延伸PCR技术,将以上二单基因作为模板,扩增首尾端带有HindⅢ和KpnI识别序列的融合蛋白Del1-9-G129R-endostatin基因片段。目的基因插入T载体测序正确后,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。结果:DNA测序结果显示融合蛋白cDNA序列与GenBank中完全一致。结论:成功构建融合蛋白真核表达载体pEGFP-N1-Del1-9-G129R-endostatin,为下一步在体外细胞水平研究融合蛋白生物学活性做好准备。