东方黏虫溶菌酶基因MseLYS的克隆与表达分析

克隆东方黏虫C型溶菌酶基因MseLYS,构建MseLYS基因的原核表达载体,检测该基因在东方黏虫不同龄期和组织的表达情况,旨在为探究MseLYS基因的功能和结构提供理论参考,也为进一步研究该基因的抗菌功能和生理机制奠定基础。以东方黏虫为研究对象,通过反转录PCR(RT-PCR)和末端快速扩增技术(RACE),获得了溶菌酶基因MseLYS的全长核苷酸序列,之后将去掉信号肽的开放阅读框架(ORF)序列连接到表达载体pET-30a(+)上,并用IPTG进行了诱导表达,最后用荧光定量PCR明确了该基因的时空表达模式。序列分析表明,此基因全长729 bp,ORF全长426 bp,5′和3′非编码区分别为75,228 bp,共编码141个氨基酸残基,其蛋白质的等电点和分子质量分别为7.72,16.13 ku。系统进化树分析结果表明,MseLYS与其他物种的C型溶菌酶聚集在一起,且与其他昆虫的氨基酸序列具有高度一致性,表明MseLYS为C型溶菌酶。SDS-PAGE电泳结果表明,MseLYS在表达菌BL21(DE3)内表达的蛋白质分子质量与预期大小一致,约20 ku,说明MseLYS在大肠杆菌中能够高效表达。龄期表达谱分析表明,MseLYS基因在东方黏虫幼虫、雄虫和雌虫不同发育阶段表达量显著不同,在末龄幼虫、蛹中表达量较高,其他发育时期表达水平较低。组织表达分析结果表明,MseLYS基因在雄虫不同组织表达量存在着显著差异,其中脂肪体和胸内表达量较高;在雌虫不同组织表达量也存在显著差异,其中触角、翅和体壁中表达量较高。综上,成功克隆了东方黏虫C型溶菌酶MseLYS基因的全长序列,构建了该基因的原核表达载体并能够高效表达蛋白质,明确了该基因在不同组织和不同龄期的表达模式。