人类RhoxF1蛋白的生物信息学分析及其自激活检测

目的:生物信息学分析人类RhoxF1蛋白的氨基酸序列,构建RhoxF1酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活活性。方法:生物信息学分析RhoxF1蛋白保守区域,比较小鼠Rhox5与人RhoxF1的氨基酸序列同源性,PCR扩增RhoxF1基因,与PMD-18-T载体连接,然后把RhoxF1克隆到pGBKT7载体中,醋酸锂法将重组质粒pGBKT7-RhoxF1转入酵母菌AH109,观察pG-BKT7-RhoxF1在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性和自激活作用。结果:RhoxF1蛋白保守区域有大量的DNA结合位点,与Rhox5具有30%的同源性。成功构建诱饵载体pGBKT7-RhoxF1,目的片段可在酵母AH109中表达,并且对酵母菌无毒性,对报告基因无自激活功能。结论:探索了RhoxF1的蛋白特性,成功构建pGBKT7-RhoxF1重组质粒,可以作为酵母双杂交诱饵载体筛选与RhoxF1相互作用的蛋白,进而对其进行功能性研究。

BRPF1新型转录本BRPF2的鉴定及其在小鼠组织中的表达

为鉴定BRPF1的一种新转录本,确定其在小鼠组织中的表达并对其蛋白功能进行初步研究,将获得的克隆进行序列测定。RT-PCR和Northern blotting实验检测BRPF1和BRPF2在小鼠各组织器官中的表达,生物信息学分析其保守结构域和蛋白功能,并使用TNT T7体外转录翻译系统获得BRPF1和BRPF2蛋白。结果表明BRPF2是BRPF1的一种新型转录本(GenBank登录号:DQ288860);在小鼠肝、胚胎、附睾、睾丸、卵巢和骨骼肌中均检测到BRPF1和BRPF2两个转录本,其中以BRPF1为主要的转录本;而在小鼠脾中,仅检测到BRPF2的转录本;BRPF1编码1246个氨基酸残基,其编码的蛋白质分子量为140 kDa;而BRPF2由于选择性剪接,导致翻译提前终止,仅编码442个氨基酸残基;CDD软件分析BRPF1和BRPF2结构域表明:与BRPF1相比,BRPF2蛋白缺失了Bromodomain结构域和PWWP结构域。鉴于Bromodomain结构域和PWWP结构域是BRPF1蛋白结合乙酰化或非乙酰化组蛋白,募集组蛋白乙酰转移酶Moz和参与染色质重构的关键,暗示BRPF2极有可能是做为BRPF1蛋白的负调控因子,共同参与染色质调控。

BRPF1及其新型转录本BRPF2与RHOX5蛋白间的相互作用

RHOX5基因是最早发现的小鼠RHOX基因簇(reproductive homeobox on the X chromosome)成员,可特异性地在生殖系统中表达。RHOX5蛋白在胚胎发育、生殖组织的发育、精子的生成和成熟等多个环节发挥作用,但其功能的发挥途径尚不明确。在前期筛选与RHOX5蛋白相互作用的分子中初步获得一个BRPF1的新型转录本BRPF2。进一步构建pGBKT7-BRPF2质粒,酵母双杂交实验确定其与RHOX5蛋白的相互作用,GST-pull down实验确定其在体外的直接结合;PCR扩增BRPF1基因,构建pGBKT7-BRPF1和pGADT7-BRPF1质粒,酵母双杂交实验和GST-pulldown实验证明RHOX5蛋白亦可以直接结合BRPF1蛋白。BRPF1及其新型转录本BRPF2与RHOX5蛋白间的相互作用证实暗示了BRPF2极有可能与BRPF1竞争性结合RHOX5蛋白,为三种蛋白功能的研究提供了新的思路。