土壤微生物生态过程与微生物功能基因多样性

土壤微生物在陆地生态系统中具有重要的生态功能,包括参与地球化学物质循环、污染物降解、环境剧烈变化的缓冲等.土壤微生物的生态功能与土壤功能联系密切,微生物群落结构与组成变化会直接影响土壤功能的发挥.土壤微生物通过具有生物活性的酶参与一系列的代谢活动,编码酶的功能基因成为微生物功能标记物.近10年中,以功能基因多样性为核心的分子生态学研究迅速发展,为从功能基因角度了解土壤微生物的生态功能提供了一个新的切入点.本文综述了与土壤微生物生态功能相关的功能基因多样性研究进展,并对该领域的发展前景提出展望.

提取北方土壤真菌DNA的一种方法

由于土壤理化性质的复杂性和真菌细胞壁结构的特殊性,从土壤样品中提取真菌基因组DNA比较困难。中国北方土壤与其它地区土壤相比有其自身的特点,因此,有必要优化一种适合于北方土壤真菌DNA提取的方法。本实验向灭菌黑土中分别投加12种在系统分类上差别较大的真菌,以传统土壤总DNA提取方法及纯菌DNA提取方法为基础,分别与蜗牛酶,纤维素酶进行组合、优化,得到7种不同的土壤真菌基因组DNA提取方法。利用真菌28SrDNA通用引物U1/U2-GCPCR-DGGE分析方法分别考察了7种不同方法所提取土壤真菌基因组DNA的多样性和代表性。结果表明:1)液氮研磨,纤维素酶、蜗牛酶和溶菌酶(浓度分别为6、3和1mg.ml-1)37℃作用60min,2%SDS于65℃裂解30min;2)-65℃～65℃冻融3次,纤维素酶、蜗牛酶和溶菌酶(浓度分别为6、3和1mg.ml-1)37℃作用180min,2%SDS于65℃裂解30min的组合具有较好的提取效果。利用后一种方法分别对3种理化性质差异较大的中国北方自然土壤样品真菌DNA进行提取并分析,表明所提取土壤基因组DNA真菌特异性PCR-DGGE图谱条带丰富,该方法可用于多种北方土壤真菌多样性研究。

长期有机污水灌溉对土壤固氮细菌种群的影响

固氮细菌是土壤生态系统中十分重要的功能群之一,在土壤氮素循环中发挥着不可替代的作用。本文通过传统培养方法和固氮基因(nifH)PCR-DGGE指纹图谱分析方法,从微生物功能群角度,研究了长期有机污水灌溉对土壤表层和亚表层固氮细菌种群数量和多样性的影响。结果表明,土壤表层固氮细菌数量随土壤污染的增高而不同程度减少,亚表层自生固氮菌数量无明显变化。从DGGE指纹图谱结果来看,对照清洁土壤的固氮细菌种群多样性较丰富,其Shannon指数在表层为2.4674,在亚表层为2.8210,分别高于受有机污水灌溉不同年限的土壤固氮细菌种群shannon指数,且种群的相似程度有所差异,说明种群结构发生了一定的变化。改清灌3a和改清灌30a土壤固氮细菌种群shannon指数分别略有增加,但种群结构并没有得到完全恢复。污水灌溉对土壤固氮细菌种群的影响具有长期的生态效应,是导致土壤生态与结构功能改变的重要因素之一。

长期灌溉含多环芳烃污水对稻田土壤酶活性与微生物种群数量的影响

以沈抚污水灌区为例,研究了长期灌溉含多环芳烃(PAHs)污水对稻田土壤酶活性、微生物种群数量的影响。结果表明,灌区稻田土壤PAHs含量在319.5～6362.8μg.kg-1。长期污水灌溉导致稻田土壤PAHs含量严重超过环境标准。随清水连续灌溉年限的增加,土壤PAHs总量不同程度降低直至低于土壤PAHs环境质量标准。相关性分析表明,在目前污染程度下,灌区稻田3大土壤微生物类群和主要功能群的种群数量主要受土壤理化性质的影响,受PAHs含量影响不明显。土壤全氮含量与细菌数量呈极显著正相关(P<0.01)。土壤酶活性受到土壤养分和PAHs污染的双重影响,土壤有机碳和全磷含量分别与脱氢酶、多酚氧化酶和脲酶活性呈极显著正相关(P<0.01),PAHs含量分别与脱氢酶和脲酶活性呈极显著正相关(P<0.01),与多酚氧化酶活性呈显著正相关(P<0.05)。

土壤抑真菌作用与细菌群落结构的关系

自然清洁土壤所具有的抑真菌作用,是健康土壤的一种自然属性,也是土壤质量的重要指标之一,对控制农作物土传病原真菌的爆发具有积极的生态学意义.本试验以中国科学院沈阳生态实验站近10年未受农药和肥料影响的撂荒地土壤作为自然清洁土壤样品,通过高温(对照、100℃、110℃、121℃)处理得到具有不同抑真菌作用的土壤模型,采用PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)方法对上述土壤样品的细菌群落结构进行分析.结果表明:土壤抑真菌作用与土壤细菌群落结构紧密相关;对照清洁土壤抑真菌作用最强,处理后土壤细菌群落结构偏离自然清洁土壤愈远,土壤抑真菌能力愈差;DGGE特异性条带切胶测序结果表明,Sphingomonas asaccharolytica、Nitrospira sp.、Hyphomicrobiaceae sp.、Bacillus megaterium和Micro-coccus sp.可能与土壤抑真菌作用密切相关.

沈抚石油污水灌区稻田土壤细菌遗传多样性——16S rDNA-PCR-DGGE分析

以不依赖于培养的16S rDNA-PCR-DGGE技术，评价了石油污染对我国最大的石油污水灌区——沈抚灌区稻田土壤细菌遗传多样性的影响，并对微生物群落中的优势菌群进行了研究。结果表明，沈抚灌区土壤总石油烃（Total petroleum hydrocarbon，TPH）含量为277—5213mgkg^-1干土，TPH在灌区干渠和支渠中的积累和分布趋势大体上是上游地区较严重，下游地区较轻，并且与土壤中有机质含量呈显著正相关（r=0．691，P〈0．05）。在目前的污染程度下，石油污水能够刺激土壤好氧异养细菌（Aerobic heterotrophic bacteria，AHB）的生长，其数量与TPH含量呈显著正相关（r=0．928，P〈0．001），而细菌遗传多样性与TPH含量呈显著负相关（r=-0．715，P=0．013）。DGGE图谱优势条带测序结果表明沈抚灌区土壤细菌群落中的优势菌群为变形细菌（Proteobacteria）β-亚群和γ-亚群的菌种，这些优势菌群的形成可能与石油烃的生物降解有关。

污水灌溉对土壤重金属含量、酶活性和微生物类群分布的影响

以沈阳张士灌区长期污灌的农田土壤为对象，研究了土壤重金属、土壤酶活性、微生物生物量和种群分布特征，分析了土壤微生物参数与土壤重金属和土壤性质的相关关系。结果表明，虽然已停止污灌十余年，张士灌区农刚土壤仍存在cd、Zn、Cu等多种重金属污染。土壤Cd污染最严重，含量达1．75-3．89mg·kg^-土壤耕作层（0～30cm）Zn、cu、Pb总含量随土层深度增加逐渐减少，而Cd元素的垂汽分布量向下迁移的趋势。cd、zn、cu、Pb等4种重金属含鲢水平分布特征相似，均为1号样地〉2号样地〉3号样地〉4号样地。相关性分析表明，张士灌区土壤酶活性、微生物生物量和种群分布受重金属污染和土壤养分的影响，土壤养分含量（有机碳、N、P、K）对微生物的正面效应大于重金属时微生物的负叫效应。土壤全量Cd和速效K对微生物参数的影响最为明显，Cd含最与多酚氧化酶活性和微生物生物量（Cmic）呈极显著负相关，与纤维素酶活性呈极品著币相梵（P〈0．01），速效K含量与多酚氧化酶活性、微乍物乍物量以搜可培养微生物种群数量均呈极显著正相关（P〈001）。

长期重金属胁迫对农田土壤微生物生物量、活性和种群的影响

调查了沈阳张士灌区长期污水灌溉造成的原位农田土壤重金属污染状况,从土壤微生物生物量、微生物活性和微生物种群数量的角度评价了长期重金属污染对农田土壤生态系统的影响.结果表明,张士灌区土壤存在严重的Cd污染,土壤Cd含量达1.75~3.89mg.kg-1,部分区域还伴有Cu、Zn复合污染.在目前污染程度下,土壤微生物生物量碳(Cmic)、微生物商(qM)、土壤脱氢酶活性以及自生固氮菌数量随土壤重金属含量增加呈下降趋势,代谢商(qCO2)随土壤重金属含量增加显著升高,而底物诱导呼吸强度(SIR)、纤维素酶活性以及细菌、放线菌和真菌数量无明显变化.相关性分析表明,土壤Cd含量变化是影响微生物参数变化的主要因素,在微生物参数中微生物商和代谢商对重金属污染最敏感.

乙草胺胁迫对土壤真菌拮抗功能和假单胞菌以及芽胞杆菌群落结构的影响

真菌拮抗功能是自然健康土壤对病原真菌所具有的免疫能力,这种能力与土壤中许多可分泌拮抗物质的细菌有关,而假单胞菌和芽胞杆菌是目前研究最多的具拮抗功能的种群。乙草胺是北方使用量最大的除草剂,目前它的施用对土壤真菌拮抗能力的影响还未见报道。本文通过室内模拟培养,考察不同浓度乙草胺(0、50、150、250mg·kg-1土)对土壤真菌拮抗能力的影响,并运用PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)方法研究真菌拮抗功能逐渐下降的土壤样品中假单胞菌和芽胞杆菌群落结构变化情况。结果表明,在实验室微宇宙条件下,乙草胺的施用会降低土壤真菌拮抗能力,在处理第12d时可以得到土壤真菌拮抗功能差异显著的土壤样品。土壤芽胞杆菌多样性随乙草胺浓度的升高而下降,而假单胞菌多样性变化不大。乙草胺胁迫下芽胞杆菌和假单胞菌群落结构都发生明显改变,尤其是芽胞杆菌(处理土壤样品与对照的群落结构相似性为0.60),且施加浓度越高,群落结构组成偏离自然土壤越远。真菌拮抗能力的降低与假单胞菌和芽胞杆菌多样性和结构的改变相关。

红酵母YR-1对偶氮染料酸性红B的脱色研究

从活性污泥中分离得到1株对偶氮染料酸性红B具有明显脱色效果的酵母菌株YR-1,鉴定为红酵母Rhodotorulasp。YR-1对酸性红B脱色机制属于降解脱色,能在30h内使质量浓度50mg·L-1的酸性红B溶液脱色率达到99%以上。研究了各种因素对酸性红B脱色效果的影响,最佳脱色条件为:初始pH为5.0、接种质量分数5%、温度30℃;最佳碳源是葡萄糖,其次是蔗糖;最佳氮源是酵母膏或蛋白胨。在替换分批脱色试验和连续补料脱色试验中,脱色率一直保持在75%以上,显示YR-1在上述脱色体系中均具有良好适应性。

长期石油和重金属污染对农田土壤假单胞菌种群多样性及结构的影响

采用PCR-DGGE方法,对我国东北地区长期石油和重金属污染农田土壤中的假单胞菌多样性及其种群结构进行研究.结果表明:石油污染区土壤中假单胞菌多样性指数显著高于重金属污染区;石油污染区旱田土壤假单胞菌多样性接近于对照清洁土壤,但低于相似污染程度的石油污染区水田土壤,表明污染物类型与耕作管理方式是影响土壤中假单胞菌多样性的主要因素.经16SrRNA的V6/V7区测序,Pseudomonas mendocina、P.stutzeri和P.aerugi-nosa是该石油和重金属污染区土壤中的优势类群,说明在长期污染胁迫下,这3种假单胞菌分别得到了不同程度的富集,推测与石油烃的自然降解及假单胞菌的重金属抗性有关.

敌敌畏降解菌的分离鉴定及降解特性研究

目的:从受有机磷农药污染的土壤中分离能降解DDVP的菌株,对其进行鉴定和降解特性研究。方法:采用DDVP为惟一碳源和能源的无机盐培养基,通过富集培养、平板划线分离得到一株优势菌,编号为DDW-1,采用形态学、生理生化和16S-rDNA序列分析对其进行鉴定,采用气相色谱测定菌株DDW-1对DDVP的降解能力,并进行底物广谱性测试和降解酶定位实验。结果:该菌株鉴定为甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)。降解特性试验结果表明,其最佳生长条件为温度28℃,初始pH为7.0,在该条件下,500mg·L-1DDVP经过DDW-1菌株代谢3d后,降解率达63.7%。结论:菌株DDW-1能降解DDVP,该菌株产胞内酶。

禽类饲用芽孢杆菌的筛选及固体发酵条件优化

筛选得到3株适用作为禽类饲料添加剂的枯草芽孢杆菌,分别命名为B395、B605和BM1。该3株菌株均能够在42℃正常生长,能抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,且能耐受0.3%胆盐,能产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶。通过饲喂试验,观察到菌剂组可明显促进肉鸡生长,有效降低料肉比。选取B395作为试验菌株,以培养后活菌数为指标,得到其最佳固体发酵条件为麦麸∶稻糠为3∶2、葡萄糖0.5%、尿素2%、KH2PO40.5%,含水量45%、接种量5%、温度37℃、培养时间3d。按上述培养条件,对B395进行培养,摇瓶式发酵可使活菌数可达到(1.3±0.1)×1010CFU/g,浅盘式发酵可使活菌数达到(1.3-1.4)×1010CFU/g;并对B605和BM1进行培养,得到活菌数均超过109CFU/g。

利用高通量测序技术对水稻秸秆中、低温降解菌系的比较分析

采用Illumina MiSeq高通量测序技术,对中、低温(中温25℃、低温10℃)富集驯化所得水稻秸秆降解菌系进行测序;采用生物信息学方法对中、低温秸秆降解菌系群落生物多样性进行分析。结果表明,测序质控后获得601489条16S rDNA序列,平均长度273 bp,经Silval 132数据库比对,中温降解菌系包括18个门,172个属,302个OTU,其中优势菌属为弓形杆菌属(Arcobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、屠场杆菌属(Macellibacteroides)、假单胞菌属(Pseudomonas)和梭形杆菌属(Lysinibacillus);低温降解菌系包括16个门,169个属,280个OTU,其中优势菌属为弓形杆菌属、屠场杆菌属、拟杆菌属、丛毛单胞属(Comamonas)和假单胞菌属。温度对降解菌系中优势菌门的相对丰度无显著影响,中、低温秸秆降解菌系主要菌属相对丰度差异显著。

短刺小克银汉霉菌丝球对孔雀绿的吸附研究

利用分离得到的短刺小克银汉霉对三苯甲烷类染料孔雀绿进行了吸附脱色研究。当染料质量浓度为100mg·L-1时,短刺小克银汉霉菌丝球能在3h内使孔雀绿脱色率达到92%以上。在通气脱色体系中研究了短刺小克银汉霉菌丝球在不同pH、脱色温度、摇床转速等条件下对孔雀绿脱色效果的影响。研究结果表明,短刺小克银汉霉菌丝球在温度为35℃,pH为10,转速为150r·min-1的条件下对孔雀绿具有最大脱色率,脱色时间在180min时达到吸附平衡。孔雀绿质量浓度为25～100mg·L-1,小克银汉霉菌丝球对孔雀绿吸附脱色动力学符合拟二级动力学方程(R2>0.99)。菌丝球对孔雀绿的吸附符合Langmuir等温吸附方程(R2>0.998),饱和吸附量达到1250mg·g-1。对吸附了染料的菌体进行解吸研究,发现用异戊醇作为解吸剂的解吸率最高,可以达到93%,解吸过程符合二级动力学方程(R2>0.99)。

短刺小克银汉霉对偶氮染料刚果红的脱色

为探索真菌对染料的脱色特性，利用分离得到的短刺小克银汉霉对偶氮染料刚果红进行了脱色研究．短刺小克银汉霉菌丝球能在3h内使刚果红脱色率达到96％以上．在通气脱色体系中研究了短刺小克银汉霉菌丝球在不同pH值、脱色温度、摇床转速、盐度等条件下对刚果红脱色效果的影响．研究结果表明，短刺小克银汉霉菌丝球在温度为33℃，pH6．5，摇床转速120r／min的条件下对刚果红具有最大脱色率，染料溶液中盐浓度对脱色率有一定影响，但影响不大．在刚果红50～200mg／L质量浓度范围内，小克银汉霉菌丝球对刚果红吸附脱色动力学符合拟二级动力学方程（R^2〉0．999）．菌丝球对刚果红的吸附等温线可用Langmuir和Freundlich等温方程模型表达，其中Langmuir方程能更好地描述菌丝球对染料的吸附行为（R^2〉0．999）．

超声波诱变选育乳链菌肽(Nisin)高产菌株

目的:从乳酸乳球菌中选育Nisin高产菌株。方法:利用超声波对乳酸乳球菌进行诱变,并用琼脂扩散法检测其效价。结果:获得一突变菌株S-1,该菌株的生物效价为343.53IU/mL,比原始菌株提高31.52%。结论:突变株S-1遗传性能稳定,为进一步菌种选育奠定基础。

动力学模型在荧光定量PCR数据处理中的优势

近年来荧光定量PCR技术凭借其基因定量的优势而得到了广泛应用,上游技术的发展保障了原始数据的精确性,但定量结果的可靠性仍取决于PCR扩增效率和所采用的数据处理模型,基于不同数学模型对原始数据处理后的结果会有较大差异。试验通过对样品进行5倍梯度稀释后获得相应梯度的荧光定量PCR原始数据,并应用2-△△Ct法、相对标准曲线法和动力学模型处理原始数据,所得定量结果(x-±s)依次为1.76±0.70、0.89±0.14和0.99975±0.06,与理论值1比较表明,动力学模型在定量结果的可靠性、方便性及经费节约方面都具有良好应用前景。

应用Vc发酵弃渣防治保护地病害

The prevention and control of tomato plant diseases were conducted in protective ground using Vc fermentation waste residue treated by enzymolysis and ultrasonic wave. The results showed that the seedlings planted for 3 weeks on the protective ground soil continuously cropped tomato plant for 9 years and fertilized 75, 150 and 300 kg·hm -2 grew well. Their biomass were increased by 123%, 164% and 182%, and the disease incidence rates were decreased by 59%, 78% and 85%, respectively. Under application of 300 kg·hm -2 Vc fermentation waste residue, the products of tomato grown for 10 weeks on the soil continuously cropped tomato plant for 9, 6 and 2 years were increased by 60%, 43% and 14%, respectively, and the disease incidence rates were all decreased by 50%.

肠毒素C2第20和22位氨基酸对其超抗原活性的影响

目的:揭示突变蛋白SEC2(T20L/G22E)超抗原活性较野生型SEC2显著增强的潜在机制。方法:WST-1法检测突变蛋白SEC2(T20L/G22E)在体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖活性,进一步应用流式细胞术和荧光定量PCR技术分别检测CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖、特异性VβT淋巴细胞增殖以及相关细胞因子mRNA丰度变化。结果:与野生型SEC2相比,突变蛋白SEC2(T20L/G22E)能够在体外显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,但二者具有相似的特异性VβT淋巴细胞增殖谱,并且SEC2(T20L/G22E)能够较rSEC2激活更多携带有Vβ5.3、Vβ8.1及Vβ8.3的T淋巴细胞;进一步体内实验发现SEC2(T20L/G22E)能够较rSEC2激活更多外周血和脾脏中CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖及相关细胞因子的表达。结论:突变蛋白SEC2(T20L/G22E)超抗原活性增强的机制可能是用亮氨酸和谷氨酸替代原来20和22位上的氨基酸后提高了SEC2(T20L/G22E)与特异性TCR-Vβ的亲和力,进一步激活更多的SEC2特异性T淋巴细胞,最终引起T淋巴细胞亚型的显著性增殖,同时诱导更多与抗肿瘤、增殖相关的细胞因子的表达。