一例猪流行性腹泻病毒与致病性大肠杆菌混合感染的诊断及分析

为明确齐齐哈尔市泰来县某猪场引起哺乳仔猪腹泻的病因,试验采集腹泻仔猪的粪便样品,通过PCR检测、细菌分离培养、16S rRNA序列测定、同源比对分析以及分离菌株的致病性试验等对腹泻仔猪的病原进行了鉴定,同时对分离菌株进行药敏试验。结果表明:在腹泻仔猪粪便样本中猪流行腹泻病毒(PEDV)呈阳性;从病料中分离出的菌株与大肠杆菌(KJ477007.1、MW301234.1等)的同源性均超过99%;将分离菌株以腹腔接种的方法注射给BALB/c小鼠,约20 h后接种分离菌株的小鼠全部死亡,剖检和HE结果显示该分离菌株致病性较强;该分离菌株对头孢噻呋、头孢吡肟存在高度敏感性;对头孢喹肟和林可霉素存在中度敏感性;对庆大霉素、恩诺沙星、卡那霉素、氟苯尼考以及阿奇霉素存在耐药性。说明该猪场的仔猪腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒和致病性大肠杆菌的混合感染所致,在进行治疗时,应结合药敏试验的结果进行用药。

3C样蛋白酶:重要抗PEDV药物的筛选靶标

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一种有囊膜的单股正链RNA病毒,属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)成员。由于冠状病毒的RNA酶缺乏校正功能,PEDV等冠状病毒的基因组易发生变异。

黑龙江东部某牛场泌乳牛跛行调查及其与产奶量、胎次和干物质采食量的关系研究

为了调查泌乳奶牛跛行与产奶量、胎次和干物质采食量(DMI)的关系,研究采用5分制跛行评价标准,对黑龙江东部某牛场376头泌乳奶牛进行跛行评价,同时记录每头实验泌乳奶牛的平均日产奶量(kg·d-1)、胎次和DMI。跛行评分结果显示,1分泌乳奶牛头数为42(11.17%),2分泌乳奶牛头数为83(22.07%),3分泌乳奶牛头数为187(49.73%),4分泌乳奶牛头数为50(13.30%),5分泌乳奶牛头数为14(3.72%)。进一步统计分析结果显示,产奶量、DMI与跛行评分呈负相关,胎次与跛行评分呈正相关;跛行严重影响泌乳奶牛的产奶量,1分与4分泌乳奶牛相比,日产奶量相差约7 kg。研究通过跛行评分调查,明确了该牛场泌乳奶牛跛行情况,以及跛行评分与产奶量、胎次、DMI的关系,为奶牛跛行的防治及其对奶牛生产的影响提供了基础。

猪干扰素α-1基因的原核表达与多克隆抗体制备

[目的]利用大肠杆菌原核表达系统对猪干扰素α-1(Po IFNα-1)基因进行表达,制备Po IFNα-1重组蛋白多克隆抗体。[方法]根据Gen Bank发表的Po IFNα-1核苷酸序列,合成密码子优化的Po IFNα-1基因,构建Po IFNα-1基因的p ET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后,利用IPTG进行诱导表达。表达的Po IFNα-1重组蛋白纯化后,免疫昆明系小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot技术检测Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体与天然Po IFNα-1的反应性。[结果]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中成功表达,针对Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体能够识别天然的猪干扰素α-1。[结论]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌中获得了成功表达,为后续研究奠定了基础。

中国几省市猪萨佩罗病毒巢式RT-PCR检测与遗传进化分析

为了准确了解猪萨佩罗病毒(Porcine Sapelovirus,PSV)在中国流行情况及遗传进化规律,试验针对PSV 5’-NTR基因利用巢式RT-PCR方法对2015~2017年来自中国部分省市规模化猪场采集的368份样品进行检测,将阳性样品对VP1基因进行克隆、测序、构建进化树。巢式RT^PCR检测结果表明,368份样品中24份样品为阳性,总阳性率为6.52%;8份样品测序成功,序列分析结果表明核苷酸同源性为77.0%~99.7%,推导的氨基酸序列同源性为83.6%~100.0%,遗传进化分析结果显示,中国地区的PSV病毒呈现出遗传多样性,其中3个毒株与德国参考毒株亲缘关系较近,2个毒株与国内外参考毒株的亲缘关系均较远,变异较大。研究丰富了PSV分子流行病学资料,为进一步研究该病毒提供了参考。

2018年大庆市某规模化猪场PEDV检测及S1基因遗传变异分析

为调查2018年大庆市某规模化猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)的感染及遗传变异情况,应用RT-PCR方法,对该规模化猪场的两个分场的仔猪腹泻样品进行PEDV S1基因扩增、测序及遗传进化分析。结果表明两个分场均存在PEDV感染;序列分析显示,两个分场PEDV S1基因序列核苷酸同源性为98.3%,推导氨基酸同源性为97.7%,与我国HGC-01-2015野毒株核苷酸同源性最高为99.0%,与2014年日本流行毒株ZK-O型毒株核苷酸同源性最低为84.9%。PEDV S1基因系统进化树分析显示,实验鉴定毒株均属于GⅡb亚群,与近年国内流行毒株及黑龙江省地区的流行毒株亲缘关系较近,与早期经典毒株CV777型毒株及国外流行毒株亲缘关系较远。

2015—2016年中国部分地区PBoV检测及遗传进化分析

为了调查2015—2016年中国部分地区猪博卡病毒流行情况,在我国各地中抽取了89份猪样本,用PCR方法对这些样本进行检测,并对其中有扩增阳性的产物进行基因序列检测,将测序结果进行对比分析,找出其中可能存在的同源性或遗传性证据。在89份检测样本中,检测出PBoV的样本42分,占比47.19%,其中山东地区的样本阳性率最低,上海、江西地区阳性率最高。NS1基因序列分析结果显示,鉴定的5株PBoV均属于PBoV 3型,且这5株PBoV的核苷酸同源性达到了80.0%~85.6%,因此,可以预测其氨基酸的同源性在82.9%至87.9%之间。将这5株进行遗传进化分析,结果显示:检测的MH822023、MH822025、MH822024、MH82022、MH82026毒株与参考KC473563、KF025390、KF025379、KF025389、KF025380毒株具有较高同源性。

2015—2017年东北地区PKV流行情况调查及其VP1基因的遗传变异分析

为了解我国东北地区猪嵴病毒(PKV)的流行情况及其VP1基因的遗传进化特征,试验通过巢式RT-PCR法对2015—2017年采集自中国东北地区(黑龙江省、吉林省、辽宁省)的122份样品进行PKV检测,分析PKV感染与腹泻的相关性,并针对PKV VP1基因进行遗传进化分析。结果表明:利用RT-PCR法检测本试验采集的122份样品,扩增PKV 3D基因的PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳,得到的目的片段与预期大小相符。PKV总检出率为88.5%(108/122),其中腹泻样品和健康样品的阳性率分别为87.9%(94/107)和93.3%(14/15)。通过卡方检验分析发现,PKV的感染与腹泻发生不存在统计学相关性(P>0.05)。本试验鉴定的7株PKV的VP1基因核苷酸同源性为80.8%～99.9%,推导氨基酸同源性为86.6%～99.6%。PKV毒株被划分为4个进化分支,本试验鉴定的7株PKV毒株在1,3,4分支均有分布。说明PKV在中国东北地区猪群中有较高的感染率,且其毒株呈现出遗传多样性。

猪源副流感病毒5型SH毒株全基因组测序及分析

目的对猪源副流感病毒5型(parainfluenza virus 5,PIV5)SH毒株进行全基因组测序及分析。方法根据GenBank中登录的猪源PIV5基因组序列设计10对引物,采用RT-PCR法对各片段进行扩增、测序,并对获得的PIV5-SH株全基因组序列进行遗传进化性分析。结果 PIV5-SH毒株基因组长15 246 nt,与传统毒株PIV5-W3A核苷酸序列同源性为98.7%。基于全基因组构建的遗传进化树显示,PIV5-SH毒株与韩国犬源PIV5(1168-1)、中国孟加拉虎源PIV5(PIV5-HMZ)、中国东北虎源PIV5(PIV5-SR)及中国小熊猫源PIV5(ZJQ-221)具有较近的亲缘关系,与传统毒株W3A亲缘关系较远。进一步以PIV5 NP、F及HN基因构建遗传进化树显示,PIV5-SH毒株与PIV5 1168-1、PIV5-HMZ、PIV5-SR、PIV5 ZIQ-221和PIV5-CAN毒株亲缘关系近。结论 PIV5不同分离株基因差异较小,表现出一定的遗传稳定性。

猪整合素β3多克隆抗体制备与鉴定

为了制备猪整合素β3多克隆抗体,试验利用大肠杆菌原核表达系统,对密码子优化的猪整合素β3基因主要抗原区进行原核表达,表达的重组蛋白纯化后,免疫Balb/c雌性小鼠,采血后分离血清,进一步通过ELISA和Western-blot对制备的猪整合素β3多克隆抗体进行鉴定。结果表明:猪整合素β3基因主要抗原区获得了成功表达,表达蛋白分子质量为102 ku左右,以纯化重组蛋白作为免疫原制备的多克隆抗体效价为1∶12 800,且能识别天然猪整合素β3。

变形蹄奶牛血清shotgun蛋白质组学分析

为了揭示变形蹄奶牛血清蛋白表达谱,探索奶牛变形蹄发生的机制,试验利用鸟枪法(shotgun)蛋白质组学技术分别对健康奶牛(UA,n=26)和变形蹄奶牛(HD,n=40)的混合血清样品进行了鉴定和生物信息学分析,进一步分析UA和HD样品的差异蛋白,并对选择的差异蛋白进行验证。结果表明:在UA样品中鉴定了393个蛋白,其中224个蛋白为高度可信蛋白;在HD样品中鉴定了409个蛋白,其中225个蛋白为高度可信蛋白。UA和HD样品中鉴定的蛋白,在分子功能、细胞进程和细胞成分分类中显示出明显的差别。在UA和HD样品中存在着24个潜在的差异蛋白,其中18个蛋白来自HD样品,6个蛋白来自UA样品;在HD样品潜在的差异蛋白中,桥粒蛋白(desmoplakin)、连接桥粒斑珠蛋白(junction plakoglobin)和钙磷脂结合蛋白A2(annexin A2)与奶牛变形蹄发生具有潜在的相关性。通过ELISA或Western-blot对UA和HD样品中的免疫球蛋白(Ig G)、牛结合珠蛋白(Bo Hp)、补体C4和补体C8进行了验证,说明变形蹄奶牛血清蛋白表达谱发生了变化。

2014—2015年黑龙江省牡丹江地区犬细小病毒2型分子流行病学调查

为了调查黑龙江省牡丹江地区犬细小病毒(CPV-2)流行情况,利用基于CPV-2部分VP2基因(568 bp)PCR的方法,对2014年5月—2015年4月收集的40份腹泻犬粪便拭子进行了检测与分析。结果显示,在40份样品中,20份样品为CPV-2阳性(50%),其中,新CPV-2a(Ser297Ala)型和CPV-2c型分为别占75%(15/20)和25%(5/20);序列分析结果显示,20个CPV-2毒株VP2基因的核苷酸和氨基酸的相似性分别为98.6%~100%和98.2%~100%;进化树分析表明,与其他国家CPV-2参考毒株相比,鉴定的新CPV-2a型毒株和CPV-2c型毒株与中国CPV-2参考毒株形成一个进化群(A),其中鉴定的新CPV-2a型毒株分布于不同的分支中。结果提示,CPV-2在牡丹江地区犬腹泻病例中呈现高感染率。