自动复合硅胶柱净化-气相色谱串联质谱法测定饲料中多氯联苯

本实验基于自动复合硅胶柱前处理结合气相色谱串联质谱技术,旨在建立同时检测饲料及饲料原料中7种指示性多氯联苯(IN-PCBs)的方法。样品中的IN-PCBs经溶剂加速萃取后,采用复合硅胶净化柱正压自动净化处理,应用岛津GCMS TQ8050三重四级气质联用仪检测,同位素稀释法定量。结果表明:标准曲线线性范围0.1~100 ng/mL,相关系数(R 2)均大于0.999,平均相对响应因子为0.91~1.14;检测限为0.6~8.2 ng/kg,平均加标回收率为88.1%~108.4%,相对标准偏差为1.0%~13.0%。与传统方法相比,本方法前处理时间短、检测灵敏度高,能够满足饲料及相关产品中IN-PCBs监测与风险评估的需求。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)检测方法的建立

根据GeneBank中已经发表的PRRSV毒株的ORF6基因高度保守序列，设计并合成了一对特异性引物，建立了用于检测PRRSV的RT—PCR诊断方法。从感染PRRSV—QD的Marc-145细胞中提取病毒RNA，然后经RT—PCR扩增，获得预期266bp的目的片断，而猪伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒（PCV）细胞培养物及Marc-145细胞进行同条件检测，结果为阴性；PRRSV扩增产物测序结果与GeneBank中已发表的PRRSV毒株序列同源性达94．4％～97．4％且应用本研究检测方法对已知基因型的10株PRRSV盲检，检出率100％。上述研究结果表明，所建立的RT—PCR诊断方法特异性好、敏感性高，可进一步应用于猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断。

用HPLC-MS／MS研究动物毛发中克伦特罗的残留及代谢规律

研究建立了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定毛发中盐酸克伦特罗残留的方法。猪毛发以0.1moL/L盐酸溶液提取,MCX固相萃取柱净化,流动相溶解定容。以SB-C18柱为分离柱,1%乙酸水溶液和甲醇(60∶40,V∶V)作为流动相,MS/MS进行定性和定量分析。在优化条件下的最低检出限为0.05μg/kg,定量限为0.2μg/kg。毛发样品中添加不同浓度盐酸克伦特罗,测得回收率在79.0%～86.2%之间,变异系数均低于15.2%。应用该方法研究了盐酸克伦特罗在猪毛发中的代谢并初步探讨其代谢机理。结果表明:在较高饲喂浓度(10mg/kg)时,用药5d后,黑色猪毛发有少量盐酸克伦特罗残留,而白色猪毛发中未检出。从第7天起猪毛发中盐酸克伦特罗蓄积量逐渐增加,最高蓄积浓度为4852.5μg/kg。

朊病毒致病机理的研究进展

就细胞型朊蛋白PrPc的分子生物学特性、朊蛋白的生理功能、致病性朊蛋白PrPsc对免疫系统的影响、朊病毒的外周致病机理以及相关细胞因子、化学因子与朊病毒神经侵袭之间的关系、朊病毒从外周到中枢的转运机制、入侵门户、血液传播及朊病的其他病理标志和检测方法的研究做一综述。

植酸酶在肉鸡饲料中的应用

1 植酸酶水解植酸盐的酶类被称为“植酸酶”.植酸酶存在于微生物、植物(尤其是种籽)和某些动物细胞中,但多数单胃动物肠道中存在的植酸酶的活性极其微弱,且易于被食物组分如钙等所抑制.目前有两种类型的植酸酶被人们所确认,一种是存在于植物、霉菌和细菌当中且需要由镁离子参与催化过程的3-植酸酶,即肌醇-六-磷酸-3-磷酸水解酶;另一种植酸酶只存在于植物的籽实中,它首先催化非植酸磷盐从肌醇的6位脱落,最终酯解整个植酸,因此叫做6-植酸酶,即肌醇-六-磷酸水解酶.后者不适于在动物饲料中应用,因为这种植酸酶的适宜pH范围为5.0～7.5,不能在pH值较低的胃中起作用;另外,这些酶还往往易于因过多的底物(植酸盐)和产物而受到强烈的抑制(Maga,1982;Ravindran等,1995).

鸡传染性囊病病毒青岛分离株VP2基因的克隆及序列分析

为了克隆传染性囊病病毒青岛分离株(IBDV-QD)的VP2基因及对其高变区序列进行分析,首先根据GenBank上已经发表的传染性囊病病毒(IBDV)UK661株的核苷酸序列,设计并合成了一对特异性的扩增IBDV-QDVP2基因的引物。以IBDV-QD株基因组为模版,利用RT-PCR技术扩增出长约1.5kb的基因片段,将其连接到pGEM-T-Easy载体上。经酶切分析、PCR鉴定及核苷酸序列测定,成功获得该分离株VP2基因的重组质粒。将IBDV-QD株VP2基因的高变区核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank中公布的14株IBDV相应序列应用软件进行同源性比较,并构建系统进化树。同源性比较和进化树分析表明,IBDV-QD与IBDV超强毒株(vvIBDV)关系最近,与标准强毒株、弱毒株、变异株相差较远;并且我国不同地区的vvIBDV存在差异,这为我国传染性囊病的流行病学调查奠定了基础。

鸡传染性法氏囊病病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已经发表的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP2基因的高度保守序列，设计并合成了一对引物，Blast在线检索GenBank数据库，未发现其他相似序列。提取已鉴定的IBDV—QD株传代病毒尿囊液的总RNA，合成cDNA模板，优化RT-PCR反应条件，最终获得预期453bp的目的片段，IBDV扩增产物经测序结果证实与GenBank中已发表的致病力不同的IBDV毒株相应序列同源性达97．4％～99．9％，最终建立了RT—PCR检测方法。用已建立的RT—PCR方法对已知的8份临床IBDV阳性法氏囊病料进行检测，阳性率达100％，另外对2份鸡白血病病毒（ALDV），2份鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV），2份鸡传染性支气管炎病毒（IBV）阳性病料进行平行同条件检测，结果均为阴性。表明所建立的RT—PCR特异性好、敏感性高，可用于鸡传染性法氏囊病的临床初步诊断及流行病学调查。

新型非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的建立

为了开发与人类非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)特征相似的动物疾病模型,本试验利用肝脏特异性Dicer1基因敲除(KO)小鼠,经高脂高糖饮食诱导12周构建了一种新型NASH小鼠模型。试验分为4组包括正常饮食的野生型小鼠组(CW组)、正常饮食的KO小鼠组(CK组)、高脂高糖饮食的野生小鼠组(HW组)、高脂高糖饮食的KO小鼠组(HK组,本试验模型组)。研究结果显示,HK组小鼠体重和肝脏比重升高,谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平显著升高;HK和HW组肾周白色脂肪和附睾白色脂肪比重均明显升高;血脂相关指标显示,HK组甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDLC)水平明显升高;口服糖耐量测试(OGTT)结果显示,HW、HK组糖耐量降低;组织病理学方面,HK组和CK组均可见肝脏脂肪变性、肝小叶炎症及纤维化,且HK组程度更为严重;此外,HK组还可见肝细胞气球样,个别肝细胞胞浆内Mallory-Denk小体,以及单个肝细胞凋亡。而HW组仅存在肝细胞脂肪变性。油红O染色证实肝细胞中的空泡为脂肪滴。天狼星红染色显示,HK和CK组存在肝纤维化。综上所述,本试验构建了一种新型非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型,与人类NASH在诸多方面特征相似,包括体重增长快、肝功异常、白色脂肪蓄积、血脂异常、糖耐量降低、以及NASH相关的肝脏病理特征。此外,该模型相对诱导周期短,且饮食结构与引起人类NASH的常见的膳食结构相似。这一新模型的建立将有助于NASH疾病机制以及治疗方面的研究。

饲料行业质量体系建设思考(一)

1饲料行业发展趋势分析 1．1饲料生产将进入低速增长期 过去数十年饲料需求旺盛，产量逐年大幅增长的时代已经结束，行业发展步入增速放缓、结构深入调整的新常态、新阶段。未来10年，我国畜禽水产品产量预期年递增0．9％～2．5％。饲料工业总产量预期年递增1％，显著低于2005—2014年7．3％的平均增幅。

国家饲料质量监督抽查结果代表性的商榷

1 国家产品质量监督抽查是国家对产品质量进行宏观控制的一项重要措施国家监督抽查是指国家质量监督机构通过对在市场或企业抽取的样品按照技术标准进行监督检验,判定其质量是否合格,从而采取强制措施,责成企业改进不合格产品,直至达到技术标准要求的一种质量监督形式.国家监督抽查是国家对产品质量进行宏观控制的强制性质量监督措施,其主要目的之一是为了弄清一个时期产品质量的状况,为政府加强对产品质量的宏观控制提供依据.

以科技为先导,促进饲料工业稳步、健康发展——祝贺《饲料和饲料添加剂管理条例》颁布实施

历经16载,我国饲料行业的"基本法"——《饲料和饲料添加剂管理条例》终于诞生了,我们奋斗在饲料科研和监测战线的全体同仁欢欣鼓舞,并对此表示衷心的祝贺!我国的饲料工业起步于七十年代中后期,经过近二十年的迅速发展,饲料工业体系已经基本形成。

液相色谱-串联质谱法测定饲料原料中26种霉菌毒素

建立了同时检测玉米、豆粕等饲料原料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇等26种霉菌毒素的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法。玉米和豆粕样品经乙腈-水-甲酸（84：15.9：0.1, V/V）超声提取1 h,取1 mL上清液经Mycospin 400多功能净化柱净化,浓缩干燥,0.25 mL水-甲醇-甲酸（95：4.9：0.1, V/V）复溶,上机测定。采用反相C18色谱柱分离,以0.1%甲酸-水和0.1%甲酸-甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱,采用多反应监测离子模式进行定性分析。基质效应考察发现,样品提取液经Mycospin 400多功能净化柱净化后,大部分毒素仍有较强的基质效应。因此,采用基质匹配标准曲线外标法进行定量分析。在高、中、低3种添加浓度水平下,26种霉菌毒素的平均回收率为61.9%~119.5%,相对标准偏差介于0.8%~18.6%之间。针对不同目标物,本方法的定量限为0.5~25μg/kg。

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定绵羊唾液中14种β-受体激动剂

以固相萃取为前处理方式,建立了超高效液相色谱-串联质谱法检测绵羊唾液中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等14种β-受体激动剂的新方法。试样用pH 5.2的乙酸铵缓冲液稀释并沉淀蛋白,离心去杂质后由MCX柱净化、浓缩,经Waters BEH C18色谱柱梯度分离,串联质谱法测定,正离子扫描,并以内标法计算结果。方法检出限为0.1～0.2μg/L,定量限为0.3～0.5μg/L。3个添加水平的回收率在60%～110%之间;相对标准偏差均小于20%。

动物尿液中盐酸克伦特罗的分子印迹固相萃取-气相色谱-质谱法研究

采用分子印迹聚合物（MIP）固相萃取小柱提取、净化并富集猪尿液中的盐酸克伦特罗分子，用N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，毛细管气相色谱-质谱联用（选择离子模式，选择离子为277、262、243和86）对衍生物分析。优化了MIP固相萃取柱的淋洗条件，考察了MIP固相萃取柱的净化效果和消除基体干扰能力，建立了对动物尿液中盐酸克伦特罗的定性、定量分析的方法。在优化条件下，本法检出限（LOD）为0．51μg／L，定量限（LOQ）为1．00μg／L；不同盐酸克伦特罗加入量的回收率为71．0％～89．3％；相对标准偏差为3．2％～9．7％。将该方法与农业行业标准方法比较，结果吻合较好。但该方法灵敏度和精密度高，操作更为简单、快捷。

分子印迹固相萃取-气相色谱-质谱法测定猪尿中4种β-受体激动剂

建立了分子印迹固相萃取结合气相色谱-质谱测定猪尿中β-受体激动剂氯丙那林、马步特罗、克伦特罗、莱克多巴胺的方法。应用分子印迹柱富集并净化猪尿液中4种β-受体激动剂,比较了分子印迹固相萃取与常规固相萃取的净化效果。通过BSTFA-1%TMS硅烷化衍生,氘代克伦特罗和氘代莱克多巴胺为校正内标,气相色谱-质谱测定。在优化条件下,4种β-受体激动剂在5～100μg/L范围内具有良好的线性关系,线性相关系数大于0.99;方法检出限低于0.5μg/L;回收率为75.1%～97.5%;相对标准偏差低于10%。利用本方法对实际样品中克伦特罗和莱克多巴胺进行测定,结果表明,本方法的精密度和准确度较好;本方法无需液液萃取,操作简单,准确性和稳定性好。

酶解及有机溶剂提取对绵羊血浆和尿样中两种β_2-受体激动剂含量测定的影响

采用酶解与有机溶剂提取对绵羊血浆和尿液进行前处理,超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定两种样品中莱克多巴胺和沙丁胺醇含量,考察了酶解、有机溶剂提取对两种β2-受体激动剂含量测定的影响。结果表明,绵羊血浆中莱克多巴胺轭合率大于95%,沙丁胺醇轭合率约为40%,添加β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶进行酶解可有效解离血浆中轭合的莱克多巴胺和沙丁胺醇,测得的含量显著提高;不经酶解处理血浆中莱克多巴胺、沙丁胺醇检测结果的相对偏差均大于40%,重复性差;绵羊尿液中莱克多巴胺轭合率约为57%,沙丁胺醇轭合率低于1%,酶解后尿液中莱克多巴胺检测结果显著提高,对于沙丁胺醇含量测定无显著影响;血浆样品基质复杂程度低于尿液样品,血浆样品目标化合物的基质抑制效应小于尿液样品;有机溶剂提取对血浆和尿液中莱克多巴胺和沙丁胺醇含量检测结果影响不显著,提取过程存在目标化合物损失的可能性,通过内标校正,可消除提取损失对检测结果的影响。