移码突变L442Cfs~*8导致的凝血因子Ⅺ缺陷症家系表型及基因型分析

目的研究一个遗传性凝血因子XI(FXI)缺陷症家系的表型和基因型,探讨其分子致病机制。方法抽取先证者及家系,共3代5人外周血,上层血浆检测凝血相关指标;PCR扩增F11的15个外显子,进行测序分析,发现突变位点后,反向测序验证;采用3种生物信息学软件(PolyPhen-2、Mutation Taster和SIFT)分析突变位点对蛋白质的影响。结果先证者及其父亲活化部分凝血活酶时间分别为92.9s、44.7s,FXI活性分别为2%、23%,FXI抗原分别为3.6%、5%,其他家系成员各项凝血指标均在正常参考范围内。先证者以及父亲F11的11号外显子发生了c.1677_1677delT杂合突变,导致L442Cfs*8杂合突变。生物信息学软件预测表明,该突变可影响蛋白质功能并导致相应疾病的发生。结论F11存在L442Cfs*8杂合突变,可能是导致患者FXI活性下降的原因,该突变在国际上也为首次发现。

FGA基因c.104G>A杂合突变导致的先天性低纤维蛋白原血症家系的基因分析

目的通过对1例先天性低纤维蛋白原血症患者家系的基因分析,探讨先天性纤维蛋白原血症的发生机制。方法采集先证者及其家系成员的外周血,进行凝血相关项目以及肝肾功能的检测,PCR扩增先证者FGA、FGB、FGG的全部外显子及其侧翼序列、5'和3'非翻译区及家系成员相应的突变位点区域,PCR产物纯化后直接测序,寻找突变位点,以反向测序验证所发生的突变;采用生物信息学工具分析该突变对蛋白质的影响。结果先证者及其父亲Fg:C、TT明显异常,而Fg:Ag水平均在正常参考范围,家系其他成员凝血指标均正常;基因测序结果显示本家系存在FGA基因第2外显子c.104G>A的错义突变(密码子CGT→CAT,即精氨酸突变为组氨酸),生物信息学软件预测结果表明,该突变的发生具有致病性。结论导致本家系成员低纤维蛋白原血症的分子机制是FGA基因Arg16His杂合突变。

两个遗传性异常纤维蛋白原血症家系分析

目的对两个因FGG基因杂合突变导致的遗传性异常纤维蛋白原血症(CD)家系进行表型和基因型分析,探讨CD的分子发病机制。方法检测两个先证者及其家系成员PT、APTT、纤维蛋白原活性(Fa)、Fib、TT、D-二聚体(D-D)、纤维蛋白(原)降解产物(FDPs)等凝血功能指标。采用PCR法扩增先证者编码Fib的FGA、FGB、FGG等3个基因,纯化产物后测序,寻找突变发生位点;采用反向测序法验证突变,同时检测其他家系成员相同基因位点;使用Polymorphism Phenotyping v2和Mutation Taster生物信息学软件预测突变位点对Fib功能的影响,利用PyMOL软件构建Fib的蛋白空间模型,预测突变对Fib结构的影响。结果两个先证者PT、APTT和TT均正常或略高于正常值,Fa明显降低(分别为0.60、0.61 g/L),Fib基本正常(分别为2.31、1.97 g/L),D-D、FDPs均在正常范围内。基因分析显示家系1先证者FGG基因存在c.952G>A杂合突变,导致292位甘氨酸突变为丝氨酸(Gly292Ser),其姐姐同样存在此基因突变;家系2先证者FGG基因存在c.902G>A杂合突变,导致275位精氨酸突变为组氨酸(Arg275His),其父亲和祖父存在相同的基因突变。Polymorphism Phenotyping v2和Mutation Taster分析提示该两种突变会引起Fib功能变化,有致病性。PyMOL突变模型提示,家系1中Fib的γ链发生Gly292Ser,突变氨基酸与周围氨基酸相互作用的氢键数量增加;家系2中Fib的γ链发生Arg275His,突变氨基酸与周围氨基酸相互作用的氢键数量减少,蛋白结构的空间稳定性均发生改变。结论家系1 FGG基因存在c.952G>A杂合突变,家系2 FGG基因存在c.902G>A杂合突变,导致翻译的Fib分子结构与功能发生致病性变化,是引起CD的主要分子机制。

1个复合杂合突变导致的凝血因子Ⅺ缺陷症家系表型及基因型分析

目的研究1个遗传性凝血因子(F)Ⅺ缺陷症家系的表型和基因型,探讨其分子致病机制。方法抽取先证者及家系(共3代8人)外周血,分离上层血浆,检测凝血相关指标;采用聚合酶链反应(PCR)扩增F11基因的13个外显子及5'端非翻译区,测序分析发现突变位点后采用反向测序验证。采用生物信息学软件(PolyPhen-2、Mutation Taster和SIFT)分析突变位点对蛋白质的影响。结果先证者活化部分凝血活酶时间(APTT)为162 s,FⅪ活性(FⅪ∶C)为2%,FⅪ抗原(FⅪ∶Ag)为3.6%,其父亲、母亲、姐姐及儿子APTT均明显延长,FⅪ∶C和FⅪ∶Ag均明显下降。先证者F11基因存在cDNA.1640G>A和cDNA.2183G>A复合杂合突变,分别来自于父亲和母亲。生物信息学软件预测结果表明,该突变可影响蛋白质功能并导致相应疾病的发生。结论F11基因存在cDNA.1640G>A和cDNA.2183G>A复合杂合突变,可能是导致患者FⅪ∶C下降的原因。

遗传性FⅦ缺陷症引起的婴幼儿颅内出血

目的 通过表型及基因分析,探讨1例非近亲婚配的遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症家系的分子发病机制。方法 检测整个家系(共4人)的凝血指标来明确诊断包括凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、血浆FⅦ活性(FⅦ:C)等。PCR扩增先证者F7基因所有外显子包括侧翼序列、5’和3’非翻译区及其他家系成员相应的突变位点区域,测序后寻找突变位点,以反向测序验证突变位点;使用生物信息学软件(PolyPhen-2和MutationTaster)预测突变位点的致病性。结果 先证者PT(61.4 s)和FⅦ:C(8%)明显异常,家系中其余3位成员PT值均正常,FⅦ:C均略低于正常对照组;基因分析显示先证者F7基因1号外显子存在c.27_28delCT杂合无义突变,8号外显子存在Cys254Arg的错义突变,先证者父亲及哥哥的F7基因分析显示有Cys254Arg杂合型突变,先证者母亲的F7基因分析显示有c.27_28delCT杂合无义突变;生物信息学分析提示提示Cys254Arg突变有致病性。结论 该家系F7基因存在c.27_28delCT、Cys254Arg两种突变,复合杂合突变的存在是引起先证者FⅦ:C低水平的主要分子机制,也是引起先证者颅内出血的主要原因,先证者两种杂合突变基因分别遗传自杂合子父母。

复合杂合变异所致遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症三个家系的遗传学分析

目的分析3个复合杂合变异所致的遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症家系的基因变异类型及其临床特征。方法选取2021年12月至2022年10月就诊于温州医科大学附属第一医院的3个家系为研究对象。检测3例先证者及其家系成员的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和FⅦ活性(FⅦ:C)。用PCR法扩增先证者F7基因所有的外显子及其侧翼序列,通过直接测序进行变异分析,并用反向测序进行验证,同时分析家系成员相应的变异位点。用ClustalX-2.1-win软件分析变异位点的保守性;用Varcards和Spcards在线软件预测变异位点的致病性;用Pymol软件分析变异前后蛋白质空间结构及分子作用力的变化。结果3例先证者的PT均明显延长,APTT在正常范围,FⅦ:C显著下降。基因分析共发现4种F7基因变异,3例先证者均携带复合杂合变异。先证者1携带p.Cys389Gly和p.His408Gln复合杂合变异;先证者2携带p.Cys389Gly和IVS6+1G>T复合杂合变异;先证者3携带IVS6+1G>T和IVS1a+5G>A复合杂合变异。保守性分析显示p.Cys389和p.His408位点在同源物种间均呈高度保守;Varcards和Spcards软件分析显示上述变异位点均为致病性;蛋白模型分析显示p.Cys389Gly和p.His408Gln变异会分别导致蛋白质空间结构改变和氢键发生变化。结论3个FⅦ缺陷症先证者的FⅦ水平降低可能分别与p.Cys389Gly和p.His408Gln复合杂合变异、p.Cys389Gly和IVS6+1G>T复合杂合变异及IVS6+1G>T和IVS1a+5G>A复合杂合变异有关,这3种复合杂合变异的组合既往均未见报道。

纯合子Cys329Gly导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系基因突变分析

目的对1个姨表近亲婚配的遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症家系进行表型和F7基因突变分析,探讨其分子发病机制。方法检测先证者及其家系成员(共4代9人)凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、血浆FⅦ活性(FⅦ:C)等来明确诊断。PCR扩增先证者全部外显子及其侧翼序列、5′和3′非翻译区及家系成员相应的突变位点区域,PCR产物纯化后直接测序,寻找突变位点,以反向测序验证所发生的突变;使用生物信息学软件(Poly Phen-2和Mutation Taster)预测突变位点对蛋白质功能的影响,利用Py MOL软件构建正常FⅦ蛋白空间模型,进行定点突变观察构型改变。结果先证者PT(36.1s)和FⅦ:C(2%)明显异常,家系中其余8位成员PT均略高于正常对照组和FⅦ:C均略低于正常对照组;基因分析显示先证者F7基因第8外显子存在c.1165 T>G纯合型突变,即TGT→GGT(Cys329Gly),8位家系成员的F7基因分析均显示c.1165有杂合型突变;两种生物信息学软件都提示此突变会引起蛋白功能变化,有致病性;F7基因蛋白构型显示突变后329位点与310位点之间二硫键消失,周边静电磁场发生改变。结论该家系F7基因存在Cys329Gly突变,是引起FⅦ缺陷症的主要分子机制,推测先证者纯合Cys329Gly突变基因分别遗传自近亲结婚的杂合子父母。

金标免疫层析法检测抗环瓜氨酸肽抗体的诊断价值评价

目的:评价金标免疫层析法检测抗环瓜氨酸肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibody,抗CCP抗体)的诊断价值,比较与其它三种试剂检测结果的一致性。方法:检测140例类风湿性关节炎(RA)患者和146例对照血清的抗CCP抗体,比较4种不同试剂检测结果间的一致程度。结果:金标免疫层析试剂检测的敏感性为83.6%,特异性为93.2%,与其余3种试剂检测结果一致性极强。结论:金标免疫层析试剂诊断类风湿性关节炎的敏感性和特异性满足临床要求,与其他试剂的检测结果一致性极强,值得临床推广应用。

一例Αα链Arg16His突变引起的遗传性异常纤维蛋白原血症家系表型和基因型分析

目的对1例遗传性异常纤维蛋白原(Fg)血症家系进行表型诊断和基因分析,探讨其分子发病机制。方法采集先证者及家系(共3代6人)外周血,上层血浆在全自动血凝仪上检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原活性(Fg:C)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白(原)降解产物(FDP)、D-二聚体(D-D)、抗凝血酶活性(AT:A)和纤溶酶原活性(PLG:A);采用免疫比浊法检测纤维蛋白原抗原(Fg:Ag)含量。采用常规血栓弹力图(TEG)和功能性Fg TEG进行凝血功能综合评价及功能性Fg评估;利用下层血细胞提取DNA,采用PCR扩增Fg 3个基因FGA、FGB、FGG的所有外显子和侧翼序列、5,和3,非翻译区,扩增产物经纯化后直接测序分析,寻找基因突变。采用生物信息学软件(Poly Phen-2、Mutation Taster和SIFT)分析突变位点对蛋白质的影响;同时采用Clustal X软件分析突变位点的物种保守性。结果先证者以及小女儿Fg:C、TT、PT明显异常,分别为0.88g/L、31.7s、16.0s和1.01g/L、26.6s、15.3s,而Fg:Ag均在正常参考范围,分别为3.54g/L和3.29g/L;家系其他成员凝血指标均在正常参考范围内。功能性Fg TEG结果显示先证者及其小女儿存在Fg功能缺陷。先证者以及小女儿FGA基因2号外显子发生了c.104G>A杂合错义突变,即CGT→CAT,导致p.Arg16His杂合突变。生物信息学软件预测结果表明,该突变可影响蛋白质功能并导致相应疾病的发生。结论该遗传性异常纤维蛋白原血症患者的FGA基因存在c.104G>A杂合错义突变,此突变与患者的Fg:C下降有关。

两个遗传性纤维蛋白原缺陷症家系表型与基因突变分析

目的对两个杂合突变导致遗传性纤维蛋白原缺陷症家系进行表型和基因突变分析,并初步探讨其分子致病机制。方法采用凝固法检测两个先证者及其各自家系成员(3代9人和2代3人)凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原活性(Fg∶C),免疫比浊法检测纤维蛋白原抗原(Fg∶Ag)。DNA直接测序法分析先证者FGA、FGB和FGG基因所有外显子和侧翼序列及家系成员相应的突变位点区域。通过凝血酶诱导进行纤维蛋白原聚集试验;用ClustalX-2、1-win软件分析突变位点的保守性;用Mutation Taster、PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和LRT在线生物信息学软件预测突变位点的致病性;用Swiss-pdb Viewer4.0.1分析突变前后蛋白质空间结构及分子作用力的变化。结果家系1先证者和家系2先证者Fg∶C明显下降(分别为1.28 g/L、0.98 g/L);家系1先证者Fg∶Ag正常(2.20 g/L),家系2先证者Fg∶Ag降低(1.01 g/L)。基因分析发现,家系1先证者的FGB基因第2号外显子存在c.293C>A(p.BβAla98Asp)杂合错义突变;家系2先证者的FGB基因第8号外显子存在c.1418C>G(p.BβSer473*)杂合无义突变。同源性分析表明Ala98和Ser473残基在同源物种间呈不同保守状态;在线生物信息学软件预测显示p.BβAla98Asp和p.BβSer473*突变为致病突变;蛋白模型分析显示,p.BβAla98Asp突变使氨基酸之间的氢键发生改变,p.BβSer473*突变产生了截短蛋白。结论家系1先证者的异常纤维蛋白原血症和家系2先证者的低纤维蛋白原血症可能分别与p.BβAla98Asp杂合错义突变及p.BβSer473*杂合无义突变有关。

严重烧伤合并获得性凝血因子Ⅴ缺陷症一例

2017年3月,笔者单位收治1例严重烧伤伴低血容量性休克患者(男,36岁),入院后,应用大量抗生素和血制品,同时多次进行植皮手术,之后患者出现创面渗血和咽喉部充血。患者既往体健,无出血或血栓性疾病家族史。实验室检查提示凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间显著延长,凝血因子Ⅴ活性极低,凝血因子抑制物定性试验结果阳性。诊断考虑获得性凝血因子Ⅴ缺陷症。应用地塞米松(5mg,2次/d),同时输注新鲜冰冻血浆,患者凝血功能指标在4d内恢复正常,且凝血因子抑制物定性试验结果阴性,出血症状改善。