异辛醇对灰葡萄孢的抑菌作用及转录组分析

为探究异辛醇对灰葡萄孢Botrytis cinerea的抑制机理,采用双皿对扣法测定了异辛醇对灰葡萄孢的抑菌效果,利用扫描电镜技术观察了异辛醇处理后灰葡萄孢菌丝的形态变化,测定异辛醇对灰葡萄孢细胞膜胞外电导率和麦角甾醇合成的影响,并基于转录组测序技术(RNA sequencing,RNA-Seq)分析了异辛醇处理对灰葡萄孢的影响。结果表明:异辛醇对灰葡萄孢菌丝的抑菌率为67.92%。经异辛醇处理后,灰葡萄孢菌丝出现大量畸形、不规则变形扭曲,细胞膜通透性增加。异辛醇处理4、5和6 d后,细胞膜麦角甾醇的含量分别降低44.35%、38.82%和42.43%;蛋白质浓度分别降低65.70%、77.93%和58.57%。转录组测序共得到577个差异表达基因(DEGs),其中312个基因表达量上调,265个基因表达量下调。通过同源蛋白簇(COG)、基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能分析,发现参与膜整体组分、麦角甾醇生物合成途径、氨基酸代谢和核糖体生物发生通路中的DEGs均显著下调,表明异辛醇可能通过影响灰葡萄孢的麦角甾醇含量、能量的产生和核糖体结构,从而起到对灰葡萄孢的抑菌作用。

多房棘球蚴感染小鼠外周血中髓源抑制性细胞比例动态变化及细胞因子表达研究

目的分析多房棘球蚴原头节感染小鼠外周血白细胞中髓源抑制性细胞(MDSC)及其亚型的比例动态变化,以及感染晚期小鼠血清中与MDSC增殖相关细胞因子的表达情况。方法将24只BALB/c小鼠随机分为感染组和对照组,每组12只。感染组小鼠经腹腔注射1200个原头节,对照组小鼠注射等量生理盐水。每组小鼠分别于感染后30、90和180 d随机各取3只,观察肝、脾组织形态学变化,并采集眼眶静脉丛外周血制备白细胞。外周血白细胞用外标抗体CD11b、Gr-1、Ly6G和Ly6C孵育后,流式细胞仪检测MDSC及其亚型多核MDSC(PMN-MDSC)和单核MDSC(M-MDSC)的占比。感染后180 d,采集感染组和对照组小鼠血清,ELISA检测白细胞介素6(IL-6)、IL-13、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的浓度。使用GraphPad Prism 9.0软件进行制图与统计学分析,两组间比较采用独立样本t检验。结果感染多房棘球蚴原头节后30 d,感染组小鼠肝组织出现囊泡,囊泡的体积随感染时间延长而增加;脾组织随感染时间延长逐渐肿大。流式细胞分析结果显示,感染后30、90和180 d,感染组小鼠外周血白细胞中MDSC占比分别为(13.2±2.4)%、(15.7±2.3)%和(41.3±4.0)%,对照组小鼠的占比分别为(12.4±3.2)%、(6.0±0.9)%和(22.3±1.1)%,感染后90和180 d感染组均高于对照组(t=3.949、4.682,P<0.05、0.01);感染后30、90和180 d,感染组小鼠外周血白细胞中PMN-MDSC占比分别为(10.9±2.1)%、(12.5±2.4)%和(35.8±3.6)%,对照组小鼠的占比分别为(9.6±3.1)%、(4.5±0.6)%和(18.5±0.6)%,感染后90和180 d感染组均高于对照组(t=3.237、4.788,P<0.05、0.01);感染后30、90和180 d,感染组小鼠外周血白细胞中M-MDSC占比分别为(1.8±0.3)%、(1.1±0.1)%和(4.6±1.1)%,对照组小鼠的占比分别为(2.3±0.2)%、(0.5±0.1)%和(3.4±0.9)%,感染后90 d感染组高于对照组(t=3.246,P<0.05)。感染后180 d,感染组小鼠血清中IL-6、IL-13、TNF-α和GM-CSF的浓度分别为(315.39±13.58)、(339.41±13.35)、(223.53±27.49)和(262.31±2.36)pg/ml,均高于对照组的(14.93±0.55)、(50.74±0.88)、(50.64±1.64)和(115.28±0.58)pg/ml(t=22.100、21.580、6.277、60.460,P<0.01或0.05)。结论感染多房棘球蚴原头节后,小鼠外周血白细胞中MDSC比例随时间延长而增加,以PMN-MDSC增加为主。感染晚期小鼠血清中IL-6、IL-13、TNF-α和GM-CSF浓度升高,可能促进MDSC的增殖与活化。

云南省洱源县人群芽囊原虫和卡耶塔环孢子虫感染情况及其分子特征

目的了解云南省洱源县人群芽囊原虫和卡耶塔环孢子虫的感染情况及其分子特征,为寄生虫病防治工作提供参考。方法2022年7—8月在云南省洱源县5个村庄采用简单随机抽样法抽取1岁以上的常住居民作为调查对象,采集调查对象新鲜粪样,收集其社会人口学信息。提取粪样DNA,使用普通PCR和巢式PCR分别扩增芽囊原虫和卡耶塔环孢子虫的核糖体小亚基RNA(SSU rRNA)基因,分析人群感染情况。对阳性PCR扩增产物进行双向测序,在NCBI进行BLAST比对分析,鉴定虫种和基因亚型,采用MEGA 11.0软件以邻接法构建系统进化树。用SPSS 21.0软件进行统计学分析,感染率的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。结果共采集100份居民粪样。芽囊原虫感染率为14.0%(14/100)。其中,男性、女性芽囊原虫感染率分别为14.6%(6/41)和13.6%(8/59);60岁以上的居民和家庭人口数为6人及以上的感染率最高,分别为18.5%(5/27)、3/15;未接受过教育和小学文化者感染率较高,分别为2/11和17.0%(8/47);感染者均为农民。不同性别、年龄、家庭人口数、教育水平和职业等人群的芽囊原虫感染率差异均无统计学意义(χ2=0.023、2.730、2.235、1.404、1.668,均P>0.05)。卡耶塔环孢子虫感染率为2.0%(2/100),感染者均为女性农民。未查见芽囊原虫和卡耶塔环孢子虫的混合感染。14份芽囊原虫阳性样本中扩增出ST1和ST3亚型序列各7条,其中7条ST1序列有25个核苷酸差异,5条与芽囊原虫(GenBank:ON932511、KU147348、MK801408、MW728079、OR754904)的序列一致性分别为100%,2条为新序列(GenBank:PP439288、PP439289),与芽囊原虫(GenBank:OP725964、KU147333)一致性为99.8%;7条ST3序列有1个核苷酸差异,与芽囊原虫(GenBank:KU147372、MK801366)的序列一致性分别为100%。扩增获得的2条卡耶塔环孢子虫序列相同,与卡耶塔环孢子虫(GenBank:KY770755)的序列一致性为100%。系统进化树显示,本研究中芽囊原虫分别与ST1和ST3亚型聚在一大分支上,卡耶塔环孢子与人源卡耶塔环孢子虫聚在同一分支上。结论云南省洱源县人群存在芽囊原虫和卡耶塔环孢子虫感染。芽囊原虫感染率较高,感染亚型为ST1和ST3亚型,ST1的遗传变异程度较高。

上海市宠物犬和猫毕氏肠微孢子虫和卡耶塔环孢子虫感染情况及分子特性研究

目的了解上海市宠物犬、猫毕氏肠微孢子虫和卡耶塔环孢子虫感染情况及分子特征,评估人兽共患传播风险。方法2021年11月—2022年6月,采集上海市某宠物医院犬和猫的新鲜粪样,提取粪样基因组DNA,巢式PCR扩增毕氏肠微孢子虫核糖体内转录间隔区(ITS)和卡耶塔环孢子虫小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)序列,阳性产物经双向测序后在GenBank数据库中进行BLAST比对。使用MEGA 11.0软件基于邻接法构建系统进化树。结果本研究共采集145份粪样(犬粪样99份、猫粪样46份),毕氏肠微孢子虫总阳性率为4.1%(6/145),卡耶塔环孢子虫总阳性率为4.8%(7/145);犬的毕氏肠微孢子虫和卡耶塔环孢子虫阳性率分别为3.0%(3/99)和6.1%(6/99),猫的毕氏肠微孢子虫和卡耶塔环孢子虫阳性率分别为6.5%(3/46)和2.2%(1/46)。6条毕氏肠微孢子虫ITS序列与人源基因型A(GenBank登录号:MK982500)的序列一致性均为100%,归在组1;7条卡耶塔环孢子虫SSU rRNA序列与人源卡耶塔环孢子虫(GenBank登录号:KJ569533)的序列一致性均为100%。系统进化树分析结果显示,毕氏肠微孢子虫分离株与已报道的人源毕氏肠微孢子虫基因型A分离株归为同一分支,卡耶塔环孢子虫的分离株与已报道的人源卡耶塔环孢子虫分离株归为同一分支。结论上海市宠物犬、猫中存在毕氏肠微孢子虫和卡耶塔环孢子虫感染,均为人兽共感染型虫株。

基于单细胞转录组测序的细粒棘球蚴感染小鼠肝T细胞异质性分析

目的 从单细胞水平探究细粒棘球蚴感染小鼠不同时期肝组织微环境细胞中T细胞亚型组成及其转录谱特征。方法 从课题组前期细粒棘球蚴感染后1个月(1只)、3个月(1只)和6个月(2只)的BALB/c小鼠和健康小鼠(1只,对照组)肝组织的单细胞转录组测序数据集(中国国家生物信息中心组学原始数据归档库:CRA008416)(https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa)中提取测序数据进行质控。采用统一流形逼近与投影(UMAP)算法对单细胞群聚类进行可视化作图,采用共享最近邻相似度(SNN)聚类算法分析最优细胞分群。采用SingleR软件包基于immgen参考数据集对细胞亚群进行细胞类型注释。使用Seurat软件包的FindMarkers函数分析不同时期感染小鼠和对照组小鼠的调节性T细胞(Treg)和CD8+T细胞的差异表达基因(DEG)。利用基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分别对DEG进行功能富集分析和通路富集分析。结果 质控后获得37 760个细胞,人工优化后分为8种类型细胞。对T细胞重聚类后获得12个细胞群。注释后鉴定获得7种T细胞,包括CD4+初始T细胞、CD4+效应T细胞、Treg、CD8+初始T细胞、CD8+T细胞、增殖性T细胞、γδ T细胞。在细粒棘球蚴感染1个月后T细胞各亚群占比无明显变化,感染后3个月增殖性T细胞(11.91%,56/470)和Treg (13.40%,63/470)占比均高于对照组(3.51%, 38/1 082;4.34%, 47/1 082),感染后6个月CD8+T细胞占比(30.20%,1 145/3 791)高于对照组(15.43%, 167/1 082)。Treg在感染后3个月高表达肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8(Tnfaip8)、Maf、伊卡洛斯家族锌指3 (Ikzf3)等维持Treg的基因;CD8+T细胞在感染后6个月高表达白细胞表面分化抗原40配体(Cd40lg)、类几丁质酶3 (Chil3)、分泌型磷蛋白1 (Spp1)等耗竭性基因。GO分析结果显示,感染后3个月Treg的DEG主要富集于转化生长因子β受体复合物组装、正调节T细胞活化、环磷酸腺苷介导的信号传导等通路;感染后6个月CD8+T细胞的DEG主要富集调节血管内皮生长因子受体、色氨酸分解代谢过程、细胞外基质细胞信号等通路。KEGG分析结果显示,感染后3个月Treg的DEG主要参与原发性免疫缺陷和Ras信号传导途径等通路;感染后6个月CD8+T细胞DEG主要参与脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢、叶酸代谢等通路。结论细粒棘球蚴感染后3个月、6个月小鼠的肝组织T细胞亚型存在差异,感染后3个月Treg占比增加,感染后6个月CD8+T细胞占比增加,Treg、CD8+T细胞的DEG及其主要富集的通路存在差异。

上海某宠物医院犬猫隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫感染率及基因型鉴定

目的了解上海市某宠物医院犬、猫隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)感染情况,并对感染虫种或基因型进行分析。方法2021年11月至2022年6月,采集在上海市某宠物医院就诊的犬、猫新鲜粪便样本145份(犬粪99份、猫粪46份)。采用巢式PCR方法分别扩增隐孢子虫核糖体小亚基rRNA(SSU rRNA)基因和贾第虫磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,TPI)基因,对阳性产物进行双向测序,利用Clustal X 2.1软件对测序结果进行拼接,采用BLAST软件进行分析比对,使用MEGA 11.0软件基于邻接法构建系统发育进化树,鉴定寄生虫虫种或基因型。结果共检测145份犬、猫粪便样本,隐孢子虫和贾第虫总检出率为20.00%(29/145);其中隐孢子虫检出率为0.69%(1/145),贾第虫检出率为19.31%(28/145)。在犬粪便样本中仅检测到贾第虫,检出率为18.18%(18/99);在猫粪便样本中,隐孢子虫和贾第虫检出率分别为2.17%(1/46)和21.74%(10/46)。经核苷酸序列分析,1份隐孢子虫阳性样本鉴定为猫隐孢子虫;28份贾第虫阳性样本均为贾第虫集聚体A,与人源贾第虫序列同源性为100%。系统进化树构建结果表明,获得的贾第虫基因序列与人源贾第虫集聚体A属同一分支。结论上海市某宠物医院就诊的犬和猫存在隐孢子虫和贾第虫感染,相关虫种和基因型均有人兽共患风险,有必要加强宠物及其饲养者隐孢子虫和贾第虫感染监测,并加强宠物饲养管理。