猪伪狂犬病灭活苗和弱毒苗联合免疫小鼠的免疫效果研究

为了优化猪伪狂犬病(PR)免疫程序,本研究将SPF级昆明雌鼠分为JZ-45组(单免灭活苗)、HB-98组(单免弱毒苗)、JZ-45/JZ-45组(两次均免灭活苗)、JZ-45/HB-98组(首免灭活苗,二免弱毒苗)、HB-98/JZ-45组(首免弱毒苗,二免灭活苗)、HB-98/HB-98组(两次均免弱毒苗)和对照组,共7组,采用猪伪狂犬病病毒(PRV)JZ-45分离株灭活苗和商品化HB-98弱毒苗,以上述相应组免疫物对小鼠免疫,在免疫后0、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d分别采血,分离血清利用间接ELISA和中和试验对小鼠血清PRV特异性和中和抗体水平进行检测;并在免疫后42 d利用PRV JZ-45株对小鼠攻毒(攻毒剂量:100 LD_(50),LD_(50)=10^(2.681)/0.1 mL,100μL/只),观察其临床症状,计算小鼠存活率,并对各组小鼠剖检观察各脏器剖检病变。取小鼠脑、脾脏制备病理切片,观察各组小鼠各组织的病变。结果显示:免疫组小鼠血清PRV抗体及中和抗体水平在0~42 d均呈持续上升趋势,且HB-98/JZ-45组小鼠血清PRV抗体水平在各时间点均高于其它组。攻毒结果显示:单免组小鼠存活率均为80%,其余免疫组小鼠均无明显临床症状,对照组小鼠全部死亡。组织病理切片结果显示:除HB-98/JZ-45免疫组小鼠脾脏、脑部无明显异常外,其他免疫组小鼠脾脏组织均有少量中性粒细胞浸润,对照组小鼠脾脏白髓灶性坏死,有大量中性粒细胞浸润,脑部组织出现炎性细胞浸润,胞质空泡化等。结果表明,在首次免疫HB-98弱毒苗的基础上加强免疫1次JZ-45灭活苗,可对小鼠获得更好的免疫保护效果。本实验比较了不同的免疫程序对小鼠免疫保护效果的差异,为后续PRV免疫程序的改进提供指导,也为更好地控制PR提供参考。

猪伪狂犬病病毒流行毒株JZ-45的分离鉴定与变异分析

利用ST细胞从猪伪狂犬病(PR)阳性样品中分离到1株猪伪狂犬病病毒(PRV),并对其生物学特性进行鉴定,扩增该毒株gC、gE全基因,进行测序和遗传进化分析。结果显示:该毒株在ST细胞盲传2~3代后出现稳定且典型的细胞病变(CPE),经6轮空斑纯化后,测其TCID_(50)为10^(-6.58)/0.1 mL;接毒培养12 h后,间接免疫荧光方法检测,可在荧光显微镜下观察到特异性免疫荧光。将纯化后的病毒液接种小鼠,测其LD_(50)为10^(-2.68)/0.1 mL,组织病理切片分析显示死亡小鼠的心脏、肝脏、脾脏等各组织具有明显的病理损伤,将100个LD_(50)病毒液接种家兔,2 d后接种兔子出现PR典型症状;同源性对比结果显示gC基因与国内经典、变异毒株同源性分别为99.2%~99.7%和99.9%~100.0%,与国外经典株同源性为96.0%~96.2%;氨基酸序列与国外经典株相比,在63位氨基酸位点处有连续7个氨基酸插入(AAASTPA);gE基因与国内经典、变异毒株同源性分别为96.7%%~99.4%和99.7%~99.8%,与国外经典株同源性为95.3%~97.8%;氨基酸序列与国外经典株相比,在492位氨基酸位点处有2个氨基酸插入(DG);遗传进化分析显示,该毒株的gC、gE基因与国内变异株位于同一进化分支,将该毒株命名为JZ-45。本试验研究结果为河南省PRV的流行病学遗传进化分析以及防控提供参考。

河南省猪伪狂犬病病毒gC、gE基因组的克隆与遗传变异分析

为了解近几年河南省猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)的遗传进化情况,本研究对2018-2020年采自河南省部分地区的307份病料样品进行双重PCR检测,并进行gC、gE全基因组克隆和序列分析。结果显示307份样品中有14份呈阳性,其阳性率为4.56%,且从14份阳性样品中分别克隆了gC、gE全基因组。核苷酸序列分析结果显示,gC基因之间的核苷酸同源性为99.6%~100.0%,与国内变异毒株HeN1-2012等的核苷酸同源性为99.8%~100.0%,与国外经典毒株Bartha等的核苷酸同源性为94.7%~95.8%;gE基因之间核苷酸同源性为98.7%~100%,与国内变异毒株HeN1-2012等的核苷酸同源性为98.7%~99.9%,与国外经典毒株Bartha等的核苷酸同源性为96.6%~97.7%。氨基酸序列对比结果显示,本研究测序14株PRV与国内经典毒株Ea株相比,gC基因有3处氨基酸突变(N34T、K99E、E194G),gE基因存在自6处氨基酸突变(G54D、P403A、V450I、496D(插入)、G510S、S518P);与国内变异毒株HeN1-2012相比,均没有发生氨基酸位点突变;与国外经典毒株Bartha等经典毒株相比gC全基因均存在第63位点处连续插入7个氨基酸(AAASTPA),并且存在30处氨基酸的替换,gE全基因存在23处氨基酸变异位点。氨基酸序列分析显示本研究测序14株PRV与国内变异毒株HeN1-2012处于同一分支,亲缘关系最近,且这些特征性变异位点可作为分子诊断依据,为河南省猪场PRV的净化提供了参考依据。

河南省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5和NSP2基因的遗传多样性及系统发育分析

为了调查猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在河南省的流行情况及变异规律,试验对2018—2019年河南省39家猪场送检的175份猪肺脏、脾脏、肝脏和淋巴结等样本进行PRRSV的PCR检测,对阳性样本扩增ORF5和NSP2基因,并进行遗传进化分析、氨基酸序列比对,同时预测ORF5基因的N-糖基化位点。结果表明:PRRSV的阳性检出率为25.71%(45/175),从45份阳性样本中扩增得到16个ORF5和10个NSP2基因序列。基于ORF5基因推导氨基酸序列的系统发育分析,检出的PRRSV阳性样本中有16株属于基因2型,可进一步划分为4个谱系;这16株PRRSV毒株在跨膜区(TM)、主要中和表位(PNE)、诱饵表位和N-糖基化位点上存在差异,免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)在77~82 aa区域高度保守。基于NSP2基因推导氨基酸序列的系统发育分析,检出的PRRSV阳性样本中有10株均属于基因2型,可进一步划分为2个谱系,并且其中类NADC30 PRRSV毒株在322~432 aa、483 aa和504~522 aa处有不连续的氨基酸缺失。说明2018—2019年河南地区PRRSV优势毒株是类NADC30 PRRSV毒株,且ORF5和NSP2基因发生较大变异。

PRRSV HeN-3弱毒株不同途径感染仔猪诱导天然免疫因子差异性比较

为了比较猪繁殖与呼吸综合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)HeN-3弱毒株经滴鼻和注射两种途径感染仔猪后诱导天然免疫因子产生的差异,经滴鼻和注射两种途径感染仔猪后,前腔静脉采集凝血与抗凝血,通过ELISA Kit检测血清中IFN-α蛋白水平;通过荧光定量PCR方法检测血清中病毒拷贝数及外周血淋巴细胞的细胞因子IFN-α、TNF-α、IL-1β的相对表达量并分析其差异;43 d后剖检仔猪,收集仔猪的肝脏、脾脏、肾脏制作病理切片,观察组织损伤情况。结果显示,两种途径感染仔猪的健康状况与对照组基本一致;注射组在3 d,滴鼻组在7 d出现病毒血症,注射组比滴鼻组的病毒血症持续时间长且血清中病毒拷贝数更高;两种途径感染仔猪外周血淋巴细胞中IFN-α的相对表达量先抑制后显著上调,血液中IFN-α蛋白水平在3,11,15 d显著高于对照组;两种途径感染仔猪的天然免疫因子IL-1β、TNF-α相对表达显著上调,但持续时间较短;两种途径感染仔猪的肝脏、脾脏、肾脏等组织器官未有明显病理变化。结果表明,PRRSV HeN-3弱毒株以滴鼻和注射两种方式感染仔猪,都未出现临床症状和病理变化,均能诱导产生一定水平的IFN-α,引起的天然免疫因子变化趋势相似。