补阳还五汤治疗大鼠气虚血瘀型脑缺血的代谢组学研究

目的:探讨补阳还五汤对气虚血瘀型脑缺血大鼠生物代谢途径的影响。方法:将30只大鼠随机分为假手术组、模型组和补阳还五汤组(3.49 g/kg)。模型组和补阳还五汤组采用荧光微球诱导多发性脑梗死合并睡眠剥夺,建立气虚血瘀型脑缺血动物模型,并分别给予蒸馏水或补阳还五汤灌胃。假手术组给予蒸馏水灌胃,不睡眠剥夺和微球注射。记录各组大鼠的体质量。实验结束后,处死大鼠,采血分析。酶联免疫吸附试验法检测大鼠血清中血栓素B 2(TXB 2)和6-酮基-前列环素1α(6-keto-PGF 1α)水平。采用液质联用的代谢组学方法检测血清样品。结果:与假手术组比较,模型组大鼠平均体质量明显降低,TXB 2/6-keto-PGF 1α比值升高(均P<0.05);与模型组比较,补阳还五汤组大鼠平均体质量升高,药物干预可降低TXB 2/6-keto-PGF 1α比值(P<0.05)。代谢组学结果显示,假手术组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),补阳还五汤组部分逆转模型组的变化,指标向假手术组回调的趋势明显。结论:模型大鼠体内的生物代谢途径受到明显干扰,补阳还五汤可以对异常生物代谢途径进行明显的调整,其调整的代谢途径包括:精氨酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、赖氨酸的生物合成。

基于证候表征生物学的中药复方功效物质基础研究思路与方法

中医临床治疗疾病多以辨证论治,其用药方式多以复方为主,中药复方又多以功效来表述。因此,中药复方的功效既包括了对疾病的治疗,也涵盖了对证候的作用。目前对中药复方功效的研究多围绕治疗疾病的药理作用及发挥作用的药效成分开展研究,而对证候的作用及发挥作用的物质基础研究不足,从而严重影响了中药复方功效的深入研究和科学阐释。其原因主要是由于证候表征的生物学基础缺乏研究,影响了中药复方功效的物质基础研究。基于此,本文首次提出基于“证候表征生物学”的中药复方功效物质基础的研究思路和方法:以中医临床为依据、以病证结合为基础、以功效为导向,在尽可能全面明确中药复方功效的证候表征生物学基础后,整合网络药理学、中药化学、中药药代动力学、生物信息学等多种现代科学技术和方法,解析、确证发挥功效的化学成分及作用机理。该研究思路突出了中医临床应用复方治疗疾病的病证结合、方证相应的用药特点,期望为中医证候及中药复方功效物质基础的研究提供参考。

基于IL-6/STAT3通路探讨参芪复方对缺血性心力衰竭大鼠Th17/Treg平衡的影响

目的观察参芪复方对缺血性心力衰竭(IHF)大鼠的治疗作用并探究其可能的作用机制。方法选取SD大鼠60只,其中50只采用结扎冠状动脉左前降支建立IHF模型后随机分为模型组、参芪复方低、中、高剂量组、福辛普利组,每组10只,另10只设为假手术对照组,只穿线不结扎。治疗组分别按不同剂量灌胃给药,模型组与假手术组给予相同容积的生理盐水,连续灌胃5周。治疗结束后,行心脏超声检测心室结构及心功能变化;采用苏木素-伊红染色(HE)观察心肌组织病理学改变;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-10水平;流式细胞术检测外周血和脾脏Th17、Treg细胞含量;免疫组化(IHC)观察心肌组织IL-6、STAT3、p-STAT3表达;蛋白质免疫印记(Western blot)检测心肌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、Foxp3、RORγt表达。结果与假手术相比,模型组LVEF、LVFS、SV、CO明显下降,LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV明显增加,并出现心肌细胞排列紊乱,伴炎性细胞浸润等病变,血清IL-17A、IL-6、TNF-α水平升高,IL-10水平下降,外周血与脾脏Th17细胞百分比增加,Treg细胞百分比下降,心肌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、RORγt蛋白表达增加,Foxp3蛋白表达下降;与模型组比较,参芪复方高剂量组心室结构与心功能指标得到改善,心肌损伤减轻,血清IL-17A、IL-6、TNF-α水平下降,IL-10水平升高,Th17细胞百分比下降,Treg细胞百分比升高,心肌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、RORγt蛋白表达减少,Foxp3蛋白表达增加。结论参芪复方可改善IHF大鼠心功能,抑制炎症反应,其机制可能与抑制IL-6/STAT3信号通路,调节Th17/Treg细胞免疫平衡有关。

基于GC-MS和网络药理学预测生姜炮制前后挥发性成分中的质量标志物

目的:基于气相色谱-质谱法(GC-MS)和网络药理学分析预测生姜炮制前后挥发性成分的质量标志物(Q-marker)。方法:基于GC-MS鉴定生姜和干姜的挥发油中化学成分,应用SIMCA软件进行主成分分析与正交偏最小二乘法-判别分析,并在此基础上探究3个不同产地的生姜炮制前后挥发性成分的差异,通过网络药理学分析差异成分作用靶点及通路,探讨生姜、干姜产生功效差异的作用机制。基于Q-marker筛选原则和网络药理学研究结果预测生姜、干姜挥发油的Q-marker。结果:通过GC-MS从生姜挥发油中鉴定出44个化合物,从干姜挥发油中鉴定出43个化合物,以差异成分作为Q-marker候选成分进行网络药理学分析,发现生姜挥发油中化学成分作用于核心靶点过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARG)、雌激素受体1(ESR1)、缺氧诱导因子-1α(HIF1A)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)等,通过过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPAR)信号通路、酪氨酸激酶-信号转导子和转录激活子(JAK-STAT)信号通路和钙信号通路等发挥作用;干姜挥发油中化学成分作用于核心靶点单胺氧化酶B(MAOB)、MAOA、ESR1等,通过环磷酸腺苷(cAMP)信号通路和Hedgehog信号通路等发挥作用。预测柠檬醛(citral)、α-松油醇(α-terpineol)、杉木醇(tau-muurolol)、依兰烯醇(ylangenol)为生姜挥发油Q-marker,香叶醛(geranial)、玫瑰呋喃(rosefuran)、白菖醇(shyobunol)为干姜挥发油Q-marker。结论:通过多元统计分析及网络药理学技术初步明确生姜炮制前后的挥发性成分及分子机制的差异,预测的Q-marker为生姜和干姜的挥发油质量标准建立及质量评价提供参考。

中国实验小型猪冠心病模型的心肌组织蛋白质组学研究

目的研究中国小型猪冠心病模型心肌组织蛋白表达谱的改变情况。方法在建立中国小型猪冠心病模型基础上,应用双向电泳分离各组小型猪心肌组织总蛋白;通过图谱分析软件和基质辅助激光解析-飞行时间质谱技术分别进行差异比较和质谱鉴定及数据比对。结果小型猪冠心病模型组心肌组织与正常组相比共有14个差异蛋白点:13个上调点,1个特异表达点。这些差异点经胶内酶解、MAL-DI-TOF质谱分析及MASCOT搜索引擎检索,鉴定出HSPA8(Hsc70)、apolipoprotein A-IV(apoA-IV)、albumin及desmin4种蛋白。结论初步发现的差异蛋白可能与冠心病的发生、发展相关,但是还需要通过其它方法做进一步验证。

非标记液相色谱-质谱联用蛋白组学并行分析策略研究

在双酶双碎裂条件下,建立了针对非标记液相色谱-质谱联用蛋白质组学的并行分析策略。应用拥有碰撞诱导解离(CID)和电子转移解离(ETD)两种碎裂方式的液相色谱-质谱联用对经胰蛋白酶和V8酶分别酶解的牛血清白蛋白(BSA)、大肠杆菌及复杂血清样品进行检测。与单酶酶解比较,双酶酶解的蛋白总发现率增加了11%,蛋白总覆盖率可增加10%以上;CID/ETD结合模式分别比CID、ETD模式多鉴定出87和263个大肠杆菌蛋白;对于复杂样品的分析,采用双酶双碎裂并行方式,可使人、猪和兔的血清蛋白检出率分别提高21%、20%和10%。采用并行策略提高了非标记蛋白组分析的效率,并且由于并行方式的互补性,为数据提供了交叉验证,使结果更为可靠。

血府逐瘀汤对气滞血瘀证大鼠血清蛋白质组表达的影响

目的:观察血府逐瘀汤对气滞血瘀证模型大鼠血清蛋白质组表达的影响,初步探讨血府逐瘀汤在分子水平的作用机理。方法:复合因素制作大鼠气滞血瘀证模型,采集正常大鼠、气滞血瘀证大鼠及血府逐瘀汤治疗组大鼠的血清,应用一种简单的方法去除血清中的白蛋白,利用双向凝胶电泳分离血清总蛋白,通过Image Master 2D Elite 6.01凝胶图像分析软件分析2-DE图谱,比较各组间蛋白表达谱的改变情况。结果:正常组大鼠血清蛋白质点为(354±20),模型组大鼠血清的蛋白质点为(347±37),治疗组大鼠的蛋白质点数为(360±35),软件分析确定的差异蛋白点有7个,其中模型组大鼠血清与正常组相比有1个蛋白质下调,5个蛋白质上调,1个蛋白表达缺失,而给予血府逐瘀汤后可改善这些改变及缺失的蛋白质的表达水平。结论:血府逐瘀汤治疗气滞血瘀证的作用机制可能与这些差异表达的蛋白有关,这为血府逐瘀汤作用的分子机理研究提供了新的思路。

混合探针法评价天龙通心方对大鼠代谢酶活性的影响

目的为预防药物相互作用导致的临床合并用药隐患,初步探讨复方天龙通心方对大鼠体内药物代谢酶的影响。方法实验大鼠随机分为空白对照组和天龙通心组,连续灌胃给药14 d后再给予CYP1A2(咖啡因)、CYP2C6(氯沙坦)、CYP2C11(奥美拉唑)、CYP2D2(右美沙芬)和CYP3A1/2(咪达唑仑)混合探针药,检测给药后不同时间点各探针药及其特异代谢底物的血药浓度,通过比较各探针药与代谢物药代动力学参数及代谢率(AUCmetablite/AUCprobe)变化,评价连续给予天龙通心方对大鼠体内CYP450代谢酶活性的影响。结果与空白对照组比较,连续给予大鼠天龙通心方后奥美拉唑峰浓度、体内暴露量均显著下降,代谢率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);探针药咖啡因达峰时间显著推迟,代谢物和探针药AUC之比(AUCratio)下降30%,但差异无统计学意义(P>0.05);咪哒唑仑及代谢产物1-羟基咪达唑仑达峰时间均延迟,而峰浓度、体内暴露水平均显著下降,原型药咪哒唑仑清除率显著升高。其他各组探针底物及其代谢产物主要药代动力学参数及代谢率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论重复给予复方天龙通心方对大鼠体内CYP2C11(人体CYP2C19)可能存在一定的诱导作用,而对CYP1A2、CYP2C6、CYP2D2和CYP3A1/2无显著影响,初步提示临床应用天龙通心方时应避免与经CYP2C19代谢的药物合并使用。

维脑康干预大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的蛋白质组学研究

目的:应用LC-MS/MS蛋白质组学方法研究维脑康胶囊治疗大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法:大鼠分为正常对照组、模型对照组及维脑康胶囊组,取大鼠全血离心获得血清,进行酶解,应用nano Chip-ESI Ion Trap进行样本分析,测定结果利用Agilent Spectral mill、scaffold及SIMCA P+等软件进行蛋白鉴定、模式判别及蛋白相对定量分析。结果:最终比对出正常对照组、模型对照组和维脑康胶囊组的总蛋白数分别为833个、701个和798个,与正常对照组相比,模型对照组分析出的差异蛋白共18个,其中上调的是13个蛋白,下调的是5个蛋白,而在维脑康胶囊组中这些差异蛋白的表达均有所恢复,其功能分别与神经元凋亡、神经元生长与分化、信号通路及转录调控等过程密切相关。结论:维脑康胶囊治疗局灶性脑缺血再灌注的作用机制可能与这些差异蛋白有关,为维脑康胶囊作用的分子机制研究提供了新思路。

猪冠心病模型与临床病人间血清蛋白组相似性比较初探

目的通过蛋白组学比较研究,发现冠心病猪模型与临床病人之间的蛋白相似性,为今后发现临床相关的蛋白标记物提供基础。方法利用非标记液相色谱质谱联用测定猪与人的血清蛋白组,通过谱库搜索鉴别,确定二者之间蛋白组中相似蛋白。结果通过测定,冠心病猪模型与临床病人之间的蛋白组在疾病相关的8个功能组上存在相似性。结论冠心病猪模型与人的血清蛋白组之间存在一定的相似性,其具体与疾病相关的蛋白组差异尚待进一步挖掘。

中国小型猪冠心病模型的蛋白质组学研究

目的：建立中国小型猪冠心病模型，研究该模型中心肌组织蛋白表达谱的改变情况。方法：采用冠状动脉球囊拉伤结合高脂饲料喂养建立中国小型猪冠心病模型，应用双向凝胶电泳、图谱分析软件、基质辅助激光解析-飞行时间质谱等蛋白质组学技术，对该模型动物的心肌组织总蛋白进行提取、双向电泳分离、差异比较、

冠心病心绞痛标志物的液质非标记筛查比较

目的通过非标记技术对血清中心绞痛蛋白标志物进行筛查。方法利用液相色谱质谱技术进行血清中蛋白酶解产物的分离测定,分别测定健康组、疾病零点(0时点)和两周三组的样本,通过蛋白搜索比较获得相关结果。结果健康组、0时点、2周的总蛋白数分别为466个、449个、483个,共有蛋白319个,比较发现血清蛋白组的差异不仅表现在蛋白种类的不同,还在于共有蛋白在整个蛋白组中的分布和相对含量的差异,通过相对量的比较,存在18个主要差异蛋白,其中13个蛋白呈上调趋势,5个呈下调趋势。结论在疾病发生过程中,主要的蛋白变化多与心脏损伤方面的过程相关,随着疾病进程,由于自身适应的作用,有部分与修复相关的蛋白有明显的变化,该结果可以为心绞痛潜在标志物的选择提供数据基础。

益气活血方及其拆方对气虚血瘀型脑梗大鼠影响的比较研究

目的:探讨益气活血方、方中益气药和活血药对气虚血瘀模型大鼠气血的影响。方法:采用荧光微球致多发性脑梗复合睡眠剥夺法制备气虚血瘀型脑梗的病证结合模型,将大鼠随机分为假手术组、模型组、益气活血方组(3.49 g·kg^(-1))、益气药组(1.08 g·kg^(-1))、活血药组(2.408 g·kg^(-1)),脑梗术后复合睡眠剥夺4周,期间每日给药1次。给药4周后测定各组大鼠的负重力竭游泳时间和脉搏幅度,取血进行脑组织血液相关指标及病理切片分析。结果:相较假手术组,模型组动物负重力竭游泳时间明显缩短,脉搏幅度也明显下降(P<0.01);模型组在各切变率下的全血黏度和血浆黏度相比假手术组均显著升高(P<0.01),血清中ET-1、Ang-Ⅱ、IL-6、IL-1β和MDA水平均升高(P<0.05)。与模型组比较,益气活血方组能延长负重游泳时间,提高脉搏幅度(P<0.05);活血药能降低各切变率下的全血黏度,益气药和全方可降低血浆黏度(P<0.05);益气药能降低Ang-Ⅱ值,益气组与活血组对ET-1都有不同程度的降低(P<0.05),全方优于益气药和活血药组(P<0.01);各给药组IL-1β值相比模型组均有显著降低,活血药组IL-6也有明显降低(P<0.01);活血药和全方MDA水平低于模型组(P<0.05,P<0.01)。病理形态学观察表明,模型组海马组织结构异常,见坏死和炎性浸润,益气组见神经元增生,活血组未见坏死区,全方组病理改变最少,且见炎性组织中细胞恢复状态。结论:益气药与活血药存在协同作用,益气以助血行,改善气虚血瘀,同时活血化瘀进而减少炎症因子及氧化产物的堆积,使全方效果既优于益气药也优于活血药。

液相色谱-质谱联用在线测定3种植物激素

褪黑激素、复合胺及吲哚乙酸等神经递质在高等植物中的发现为理解植物生理的机制提供了新的可能性。建立了一种在线制备方法,将样品粉末化后装填入小柱,利用水、甲酸-水和甲醇-水在线预洗制备后,切换至分析流路,采用梯度洗脱及ESI源LC-MS/MS检测植物中3种神经递质,每个样品的检测时间10 min,较离线方法的分析时间缩短了1/2,且不损失方法的准确度及精密度;回收率较离线方法提高约4%。

温胆汤治疗高脂血症金黄地鼠的肝脏代谢组学研究

目的:应用代谢组学方法研究温胆汤对高脂血症金黄地鼠治疗作用的生物学机理。方法:选取34只金黄地鼠随机分为正常组、模型组各11只,温胆汤组12只,采用血脂4项血清生化指标评价高脂血症模型以及温胆汤的干预作用,应用液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)进行各组大鼠肝组织内源性代谢物分析,采用偏最小二乘法-判别分析(partial least squares discriminant analysis PLS-DA)对多变量数据进行分析。结果:与模型组比较,温胆汤组总胆固醇(total cholesterol,TC)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平明显降低(P<0.05),通过多元数据分析显示模型组与正常组区分明显,温胆汤给药组有明显向正常组回调的趋势,其中甲硫氨酸、磷脂酰胆碱、腺苷、尿刊酸等20余种成分受到了温胆汤的调节。结论:温胆汤可以调节高血脂金黄地鼠的体内异常代谢途径,提示其治疗作用可能通过对磷脂酰胆碱代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢等生物途径的调节实现。

HPLC波长切换法同时测定黄芩-甘草药对中9种成分含量

目的建立HPLC同时测定黄芩-甘草药对中芹糖甘草苷、甘草苷、异甘草苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸和汉黄芩素含量的方法,探讨黄芩-甘草配伍前后这9种主要成分含量变化规律。方法采用Phenomenex Synergi Polar-RP 80A色谱柱(4.6 mm×250 mm,4μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸,流速1.0 mL/min,柱温35℃,通过梯度洗脱和多波长切换技术,测定黄芩-甘草药对配伍前后9种主要成分的含量。结果芹糖甘草苷、甘草苷、异甘草苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、甘草酸和汉黄芩素的线性范围分别为0.0325~1.0400μg(r=0.9999)、0.0509~1.6300μg(r=0.9999)、0.0078~0.2480μg(r=0.9999)、0.4369~13.9800μg(r=0.9998)、0.0403~1.2900μg(r=0.9999)、0.0784~2.5100μg(r=0.9999)、0.0254~0.8120μg(r=0.9999)、0.0856~2.7400μg(r=0.9997)、0.0043~0.1390μg(r=0.9997)。黄芩和甘草配伍后,芹糖甘草苷含量升高(P<0.01),甘草苷含量降低(P<0.01),其他成分含量无明显变化。结论本研究建立的方法稳定、准确,可为黄芩-甘草药对及其制剂的质量评价和控制提供依据;黄芩-甘草配伍后部分成分含量发生变化。

鸡尾酒探针法评价中药塞络通对大鼠代谢酶的影响

目的:为预防合并用药产生的药物相互作用,考察治疗血管性痴呆的中药复方塞络通对大鼠主要药物代谢酶的影响。方法:大鼠分别灌胃给与塞络通及组方药人参、银杏叶和西红花提取物后再给与混合了大鼠CYP1A2 (咖啡因)、CYP2C(奥美拉唑和氯沙坦)、CYP2D2 (右美沙芬)和CYP1A1/2(咪哒唑仑)探针药组成的鸡尾酒探针,测定给药后不同时间点各探针及特异代谢底物的血药浓度,通过分析探针药及其代谢物药代参数及代谢率(代谢物与探针AUC之比),评价单剂量塞络通对大鼠主要CYP450酶活性的影响。结果:与空白对照相比,塞络通单次给药后没有发现各探针药代谢率有统计学意义的改变(P> 0. 05)。但探针药咖啡因的达峰时间显著推迟,代谢物峰浓度显著升高,代谢率的指标上升了31%,与人参给药后趋势较一致。单剂量塞络通使右美沙芬代谢物AUC值显著降低,代谢率下降了37%,影响主要来自于银杏叶提取物。结论:单剂量塞络通不会显著影响大鼠主要CYP450s酶代谢活性,整方变化趋势与组方药的合并作用吻合。

基于液质联用技术对早期高脂血症金黄地鼠肝脏鞘脂的靶向代谢组学研究

目的对高脂血症金黄地鼠肝匀浆中鞘脂进行相对定量的靶向代谢组学研究。方法18只SPF级叙利亚金黄地鼠随机分为正常对照组和高脂血症模型组,饲喂6周后进行血液生化检测,取肝脏进行HE染色,观察两组动物血液生化指标和组织病理学变化。基于液质联用技术,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法分析(PLS-DA)进行模式识别,对鞘脂种类进行相对定量分析。结果高脂血症模型组TG、TC、LDL-C、HDL-C水平明显高于正常对照组,均具有统计学差异。肝组织结构紊乱,肝细胞大片气球样变性,灶性小泡性脂肪变,肝细胞肥大致肝窦不明显,枯否细胞增生,肝小叶内可见炎细胞聚集灶,汇管区轻度炎细胞浸润及纤维组织增生。21种鞘脂,包括鞘磷脂(sphingomyelin,SM)、神经酰胺(ceramide,Cer)和葡糖基神经酰胺(glucosyl-ceramide,Glc-cer)在高脂血症仓鼠肝脏出现异常改变。其中,9种Cer上调,4种Glc-cer下调,8种SM中有3种上调,其余5种下调。结论早期高脂血症金黄地鼠的围绕神经酰胺的鞘脂的代谢途径被破坏,可能触模型组的胰岛素抵抗和炎症反应,导致肝脏损伤,影响血脂代谢。基于LC-MS的鞘脂途径的靶向代谢组学研究为了解高脂血症的生物学机理提供了更多有用的信息。

基于液质联用技术的高脂血症金黄地鼠肝脏非靶标代谢组学研究

采用液相色谱-飞行时间质谱联用技术(LC-TOF MS)对高脂血症金黄地鼠的肝匀浆液进行代谢谱分析,并利用模式识别挖掘潜在生物标志物以探索发病机制。采用反相色谱(RPLC)和亲水作用色谱(HILIC)两种模式分离肝匀浆液中的内源性代谢产物。采用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)进行数据分析,结合标准品与数据库比对、二级质谱裂解规律对内源性成分进行定性分析。结果显示,模型组和对照组在RPLC和HILIC两种分离模式下均有良好的区分。与对照组相比,在高脂血症组的金黄地鼠肝脏中鉴定出16种差异代谢物,其涉及的主要代谢途径为嘌呤代谢、磷脂酰胆碱代谢、鞘脂代谢和赖氨酸代谢等。这些异常的内源性成分及其生物代谢途径可为了解高脂血症金黄地鼠肝脏发病机制提供依据。