江西省黄鼬和鼬獾狂犬病流行病学监测

目的为确定江西省除鼬獾外夜行肉食类野生动物黄鼬是否携带狂犬病病毒,对该地区黄鼬和鼬獾进行狂犬病流行病学监测,分析其感染状况。方法在江西部分地区采集黄鼬和鼬獾脑组织样品,直接免疫荧光法(FAT)检测样品中狂犬病毒抗原,小鼠颅内接种实验(MIT)分离病毒,RT-PCR扩增其核蛋白和糖蛋白全基因进行测定,并与我国其他地区狂犬病病毒的核酸序列进行对比分析。结果黄鼬脑组织样品FAT结果阳性率为0(0/1 102),鼬獾阳性率为1.9%(4/210)。经MIT分离到4株狂犬病病毒之间N基因和G基因的同源性较高,分别为99.6%～100%和99.7%～100%,与浙江和江西其它鼬獾狂犬病病毒分离株同源性为96.0%～99.3%和98.7%～99.1%,与浙江和福建犬源分离株(ZJ-QZ,D01,FJ008,FJ009等)同源性为88.2%～88.8%和87.6%～87.7%。结论采样地区黄鼬样品中未发现狂犬病病毒感染,而鼬獾感染狂犬病病毒阳性率较高,说明其种群内存在狂犬病的流行;犬与鼬獾狂犬病病毒株同源性较低,二者交叉传播或溢出的可能性较低;黄鼬和鼬獾尽管同属夜行动物,但二者交互感染的可能性很低。有必要对该地区野生动物狂犬病进行长期监测。

鲤鱼鳍条细胞的原代培养

通过对鲤鱼鳍条细胞进行原代培养,摸索出最佳的培养条件。采用组织块培养法,取一小块鳍条组织在不同培养基、温度、pH、CO2等培养条件下进行培养,对其生长状况进行观察。培养48 h可见组织块周围有细胞迁出,并形成生长晕,培养1周可形成单层细胞,主要由上皮样细胞和少量成纤维样细胞组成。本研究初步确立了鲤鱼的鳍条细胞培养条件为：培养基为M199,培养温度为25~27℃,pH为7.2~7.6,CO2浓度为5%,原代培养血清浓度为15%~20%,连续培养12 d后可得到纯化的鳍条细胞。

鲤春病毒血症病毒核蛋白的原核表达及初步鉴定

为原核表达鲤春病毒血症病毒(SVCV)核(N)蛋白,本研究采用RT-PCR方法扩增SVCV N蛋白基因(SVCV-N),克隆于原核表达载体pET-28a(+)中,并转化到大肠杆菌Rosetta中进行表达。SDS-PAGE分析表明,SVCV-N基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物约47 ku,与预期相符。Western blot检测表明,该重组蛋白可以被SVCV阳性血清所识别。

5种外来动物疫病并联荧光定量PCR检测方法的研究

根据GenBank中发表的相关病毒的基因序列,通过分析比较小反刍兽疫病毒(PPRV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、西尼罗河热病毒(WNV)、亨德拉病毒(HeV)和尼帕病毒(NiV)的保守区域(PPRV的N基因、ASFV的P72基因、HeV和NiV的H基因,以及WNV的PrM基因),各设计筛选出一套特异性引物和Taqman探针,建立了5种外来动物疫病并联荧光定量RT-PCR检测方法。利用该方法,对103份样本进行了临床检测,结果除阳性对照外,其他均为阴性。检测结果验证了本研究建立的Taqman模式并联荧光定量PCR检测方法具有鉴别诊断的特点,可以作为临床检测这5种病原体的参考方法。

5种外来病病毒多重RT-PCR检测方法的建立

通过GenBank中对小反刍兽疫病毒N蛋白基因、亨德拉病毒及尼帕病毒H蛋白基因、西尼罗河热病毒PrM蛋白基因和非洲猪瘟病毒P72基因这5种外来病病毒的主要基因的分析比较,选择相应基因的保守序列进行人工合成,并对每段基因设计2对引物,扩增片段大小均在350-550bp之间。通过对条件的反复优化,建立了1种能够同时检测到这5种病原的并联PCR/RT-PCR方法。结果显示,该方法最低可检测到10-5 mg/L的病毒的DNA/cDNA,而且特异性强、重复性好。在45份猪样品及56份蝙蝠样品的检测中,只有阳性对照出现了目的条带,而其他均未出现目的条带。这说明本研究建立的5种主要外来病病毒并联PCR/RT-PCR的检测方法具有灵敏度高、特异性好的特点,可用于ASFV、PPRV、HeV、NiV和WNV的预防、检测及扑灭。