以TROP2为靶点的抗体偶联药物相关研究进展

滋养层细胞表面抗原2(trophoblast cell surface antigen 2,TROP2)是一种I型跨膜细胞表面糖蛋白,最初被认为是滋养层细胞的表面标志物,但后来发现它在许多实体肿瘤中表达量增加,而在正常组织中表达量较少,这样的表达差异使TROP2成为肿瘤治疗的潜在靶标。2020年4月首个靶向TROP2抗体药物偶联物(ADC)IMMU-132成功获批上市,使得TROP2成为肿瘤靶向治疗的明星靶标,并引发了以其为靶点的ADC研发热潮。目前,已有多个以TROP2为靶点的新型ADC药物进入临床研究阶段。本文将针对TROP2的结构和功能、在实体瘤中的表达以及TROP2靶向ADC药物的最新研究进展进行综述。

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv(3G11)在大肠杆菌的表达及其抗肿瘤活性

目的制备抗IV型胶原酶单链抗体(scFv),用于构建小型化抗肿瘤抗体靶向药物。方法构建重组表达质粒pET-scFv,并在大肠杆菌进行诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot法对表达蛋白进行鉴定,分步透析复性。ELISA法、免疫细胞化学染色法检测scFv对靶抗原和肿瘤细胞的结合活性,明胶酶谱法检测对IV型胶原酶活性的抑制作用。Boyden Chamber法测定对肿瘤细胞侵袭的影响。动物试验肿瘤模型检测在小鼠体内的抗肿瘤活性。结果表达的单链抗体scFv(3G11)以包涵体的形式存在,经变性和复性后,对抗原IV型胶原酶和肿瘤细胞的免疫反应呈阳性,抗体亲和常数为6×107/mol/L。不仅可以抑制HT-29细胞和HT-1080细胞分泌的Ⅳ型胶原酶活性,还可以体外抑制肿瘤细胞的侵袭,抑制程度与浓度呈剂量依赖关系。scFv(3G11)4mg/kg对小鼠移植性肝癌H22的抑瘤率为49.4%(P<0.01)。结论scFv(3G11)保留了完整抗体的抗原结合和抑制活性,能够与肿瘤细胞特异性结合,并在小鼠体内有中度抑瘤效果。scFv(3G11)的相对分子质量远小于完整抗体,可作为肿瘤靶向药物的理想载体。

抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv (3G11)联合顺铂的抗肿瘤活性

目的研究抗Ⅳ胶原酶基因工程单链抗体scFv (3G11)联合顺铂的抗肿瘤效果。方法明胶酶谱法、Western-blot法研究顺铂对肿瘤细胞分泌Ⅳ胶原酶蛋白的影响,MTT法、实验动物肿瘤模型研究scFv (3G11)与顺铂联合在体外和体内试验中的抗肿瘤效果。结果顺铂可抑制肿瘤细胞分泌的Ⅳ胶原酶活性,scFv (3G11)与顺铂联合在体外试验中可抑制人肝癌BEL-7402细胞的生长,体内试验中对小鼠移植性肝癌H22有显著的抑制作用,药物相互作用指数(CDI值)<1。结论scFv (3G11)和顺铂联合应用对肝癌的治疗有协同作用。

治疗性抗体的市场考量和靶点分析

近年来，单抗药物因其独特的分子靶向性和良好的临床疗效成为全球研发的热点，治疗性抗体成为产业界及学术界合作研发的令人振奋的领域。目前，在美国和欧盟有约33种市场在售和约30种处于临床III期的治疗性抗体药物，主要用于肿瘤、炎症和自身免疫病及其他一些疾病的治疗。主要对近几年单抗药物的市场状况及治疗靶点进行了概述。

IL-3-LDM融合蛋白对CD123^＋白血病细胞的靶向杀伤作用

目的:构建以IL-3为靶向、力达霉素(lidamycin,LDM)为弹头的融合蛋白IL-3-LDM,观察其对多种CD123+白血病细胞的靶向杀伤作用。方法:原核表达IL-3-LDP(interleukin 3-lidamycin)融合蛋白,组装活性烯二炔(active enediyne,AE)发色团得到IL-3-LDM。流式细胞术检测不同白血病细胞系(KG1-a、TF-1、M07e、HL-60、K562、Raji)表面CD123分子的表达,并检测融合蛋白IL-3-LDM与各白血病细胞的结合能力;CCK-8检测IL-3-LDM融合蛋白对不同CD123阳性率的白血病细胞的杀伤能力。结果:组装活性发色团得到的IL-3-LDM蛋白纯度可达90%以上。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)KG-1a细胞表面CD123阳性率最高(88.9%),其次为MO7e和TF-1细胞(>75%),再次为HL-60细胞(7.8%),而K562、Raji细胞CD123表达呈阴性。体外IL-3-LDM融合蛋白对CD123+白血病细胞(KG-1a、MO7e、TF-1和HL-60细胞)的结合能力和杀伤效率与细胞表面CD123的阳性率成正比,对于CD123表达率最高的KG-1a细胞,LDM的杀伤强度是多柔比星(adriamycin,ADR)的1 415.8倍,而IL-3-LDM的杀伤强度又是LDM的9.6倍。结论:IL-3-LDM融合蛋白可以有效携带细胞毒药物LDM并高效靶向杀伤CD123+白血病细胞。

靶向表皮生长因子受体的寡肽与力达霉素强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性

背景与目的:表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在多种肿瘤细胞表面异常表达。力达霉素是从链霉菌中分离得到的具有强抗肿瘤作用的烯二炔类抗生素。本研究的目的是制备一种特异性靶向EGFR的寡肽配体与力达霉素的强化融合蛋白(Ec-LDP-AE),并初步探讨其抗肿瘤活性。方法:制备融合蛋白(Ec-LDP),并分离纯化,用高效液相色谱法检测Ec-LDP的纯度,ELISA、流式细胞技术以及细胞免疫荧光方法分析纯化的Ec-LDP蛋白对不同肿瘤细胞的免疫结合活性。将纯化的Ec-LDP蛋白与力达霉素发色团进行组装,构建Ec-LDP-AE,用高效液相色谱法检测350nm处的吸收峰,MTT法检测Ec-LDP-AE的体外抗肿瘤活性。结果:成功构建并表达了Ec-LDP蛋白,目的蛋白分泌至大肠杆菌周质腔中,产量为每升发酵液18mg活性蛋白,其纯度为95.3%。ELISA和细胞流式检测结果均显示Ec-LDP蛋白对EGFR高表达的肿瘤细胞系A431和MCF-7都有很强的免疫结合活性,而对不表达EGFR的NIH3T3细胞则无结合活性。免疫荧光实验也证实Ec-LDP蛋白可与A431细胞膜受体结合。Ec-LDP-AE蛋白在350nm波长处出现特定吸收峰,表明其构建成功。MTT法检测结果显示Ec-LDP-AE对体外培养的肿瘤细胞有强烈的杀伤作用,对MCF-7和A431细胞的IC50值分别为3.06×10-11mol/L和9.38×10-13mol/L。结论:本研究制备的强化融合蛋白Ec-LDP-AE对表皮生长因子受体有靶向作用,并且保留了力达霉素的强烈细胞毒作用。

HPLC法测定米铂白蛋白结合型纳米制剂中米铂的含量

目的建立米铂白蛋白结合型纳米制剂中米铂含量测定的高效液相色谱(HPLC)法。方法采用HPLC测定米铂白蛋白结合型纳米制剂中米铂的含量。色谱条件:辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),甲醇-乙腈-水(91:1:8)洗脱,流速1.0 ml/min,检测波长210 nm,柱温30℃,进样量20μl。结果建立了简便可行的米铂白蛋白结合型纳米制剂样品前处理方法;建立并验证了HPLC方法,线性范围3.63~130.80μg/ml(r=0.9995);低、中、高3个浓度的平均回收率(n=3)分别为(99.46±0.24)%、(99.20±1.38)%、(98.30±0.26)%;日内、间精密度RSD分别为1.62%(n=6)和1.32%(n=6);流速在0.99~1.01 ml/min范围内变化时米铂峰面积的RSD为1.01%(n=9),柱温在28~32℃之间变化时米铂峰面积的RSD为1.14%(n=9)。结论本文建立的含量测定方法简便易行,专属性强,灵敏度高,耐用性好;可定量检测米铂白蛋白结合型纳米制剂中米铂的含量。

抗CD30抗体药物研究进展

CD30是肿瘤坏死因子受体超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF）成员之一，属于 I 型跨膜糖蛋白，过表达于霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma， HL）和间变性大细胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphomas， ALCL），低表达于非病理状态下活化的 T 细胞、B 细胞表面，而正常细胞不表达[1]。早期研究表明，CD30参与细胞活化和分化，NF-κB 等信号的传导以及 T 细胞免疫激活等[2]。目前的研究证实 CD30与细胞的增殖和死亡密切相关[3]，其胞内部分可与 TNFR 相关因子（TNFR associated factor，TRAF）家族多个成员相互作用，既能通过 JNK 和p38途径介导细胞的凋亡，又能通过 NF-κB 途径介导细胞的活化[4-5]。CD30激活后其胞外部分很快被蛋白酶降解，形成可溶性的 sCD30。正常情况下人体血清中的 sCD30含量很低，但在许多病理状态下，sCD30水平会明显升高，可作为疾病诊断的指标。由于 sCD30在 HL 和 ALCL 患者血清中的含量升高，因此可作为肿瘤标志物[6]。

HER3与肿瘤及肿瘤耐药的关系研究进展

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）家族属于受体酪氨酸激酶,包括4种I型跨膜受体：EGFR（HER1）、HER2（Neu,ERBB2）、HER3（ERBB3）和HER4（ERBB4）。这些受体均包含细胞外区、跨膜区和胞内区3个部分,其中细胞外区包含4个结构域,胞内区包含1个用来信号传导的细胞内酪氨酸激酶结构域和1个位于胞浆内的带有酪氨酸磷酸化残基的尾部。

GPNMB与肿瘤靶向治疗

非转移性黑色素瘤糖蛋白B(glycoprotein non-metastatic melanoma protein B,GPNMB)是一种高度糖基化的I型跨膜糖蛋白,定位于细胞膜或贮存于内涵体及溶酶体中。膜结合型GPNMB可被金属蛋白酶如ADAM 10裂解,释放出可溶性形式。该蛋白最初被发现于非转移性黑色素细胞而得名,后来还被发现在其他多种正常组织和癌组织中均有表达[1-2]。

抗人CD30单克隆抗体的制备和活性研究

目的制备抗人CD30单克隆抗体并进行活性研究,为其作为抗体偶联药物的靶向运输载体提供研究依据。方法通过基因工程技术构建真核表达载体pIZDHL-CD30-Ig G,将质粒稳定转染CHO/dh Fr^-细胞并筛选,获得稳定表达anti-CD30-IgG抗体的细胞株并纯化抗体,通过HPLC检测其纯度。ELISA、Biacore和流式细胞术实验检测anti-CD30-IgG的亲和活性;免疫荧光共聚焦实验观察其在肿瘤细胞的内吞情况;利用小动物活体成像技术研究抗体在NOD/SCID鼠移植瘤模型中的靶向性。结果成功构建了anti-CD30-IgG抗体的表达载体,并筛选出稳定表达的单克隆细胞株CHO-CD30-IgG,纯化后的抗体anti-CD30-IgG纯度达到98%以上。Anti-CD30-IgG与重组人CD30抗原具有很好的亲和活性,亲和常数为4.15×10~8 L/mol,其可通过肿瘤细胞表面CD30受体介导的内吞进入细胞。在NOD/SCID小鼠L540和Karpas299移植瘤模型中,anti-CD30-IgG可以选择性地富集并滞留在肿瘤部位。结论 Anti-CD30-IgG对抗原和肿瘤细胞具有高亲和性和特异性,并且可被内吞进入肿瘤细胞内部,在小鼠体内可选择性靶向并且长时间滞留在肿瘤部位,可作为抗体偶联药物中"弹头"部分的靶向输送载体。

抗肿瘤药物靶点Trop2研究进展

Trop2是人滋养层细胞表面糖蛋白抗原2,又名肿瘤相关钙离子信号转导子2(TACSTD2)、表皮糖蛋白1(EGP-1)、胃肠肿瘤相关抗原(GA733-1)、表面标志物1(M1S1),是由染色体1p32区域的Tacstd2基因编码表达的细胞表面糖蛋白[1-2]。Trop2属GA733蛋白家族,与上皮细胞黏附分子(EpCAM,又称Trop1、TACSTD1)有较高结构序列相似性,同源性达49%。研究证明,Trop2可能是EpCAM信号通路调节中的增强子[3]。Trop2蛋白初级结构是由323个氨基酸组成的36 kD的多肽,初级结构经N-端糖基化翻译后修饰,形成不同于EpCAM的I型细胞膜糖蛋白,即Trop2蛋白。Trop2蛋白横跨细胞膜,N-端为胞外域(Trop2EC),该胞外域通过一个单向跨膜螺旋(TM)与由26个氨基酸残基构成的疏水性多肽的胞内短尾(Trop2IC)连接,从而固定于胞膜[4]。

间皮素与肿瘤靶向治疗

间皮素(mesothelin,MSLN)是一种细胞表面糖蛋白,在正常组织中很少表达,但在卵巢癌、胰腺癌和恶性间皮瘤等肿瘤组织中高表达[1],因此间皮素有望成为癌症治疗的重要靶点。由于间皮素基因敲除小鼠未发现表型异常,所以间皮素的生物学功能目前仍不清楚,但有研究表明间皮素可能在肿瘤细胞增殖、黏附及耐药性方面起着重要作用。采用抗间皮素抗体、抗体偶联药物(ADC)、免疫毒素、嵌合抗原受体T细胞、间皮素肿瘤疫苗等手段,治疗高表达间皮素的肿瘤的方法正在发展,并逐步走向应用。本文将针对间皮素的结构与功能、在恶性肿瘤中的表达及以其为靶点的药物研究进展情况进行综述。

靶向CD30单克隆抗体^(64)Cu-NOTA-CD30的淋巴瘤免疫PET显像研究

目的制备靶向CD30单克隆抗体(简称单抗)^(64)Cu-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)-CD30,无创性可视化评价淋巴瘤CD30的表达。方法通过Western blot评价5种淋巴瘤细胞株(Karpas299、Raji、Daudi、Ramos和U266)中CD30的表达水平。选择高和低表达CD30的细胞株行流式细胞术评估抗CD30单抗特异性结合能力。取NSG小鼠13只构建CD30阳性和阴性皮下荷瘤鼠模型。标记获得^(64)Cu-NOTA-CD30,以^(64)Cu-NOTA-免疫球蛋白(Ig)G为对照探针。经尾静脉注射2种探针后2、24和48 h行microPET显像及生物分布分析。采用重复测量方差分析及Bonferroni法进行数据比较。结果Karpas299细胞呈CD30高表达,Raji细胞呈CD30低表达。流式细胞术示抗CD30单抗与Karpas299细胞特异性结合。^(64)Cu-NOTA-CD30与^(64)Cu-NOTA-IgG的放化纯均>95%。在microPET显像中,Karpas299肿瘤^(64)Cu-NOTA-CD30摄取随时间延长逐渐升高,2、24和48 h分别为(11.46±0.58)、(17.60±1.16)与(19.46±0.99)每克组织百分注射剂量率(%ID/g);48 h时与本底对比度良好,肿瘤与心(血液)比值为2.20±0.22。48 h时,^(64)Cu-NOTA-CD30在Karpas299肿瘤的摄取高于其在Raji肿瘤[(6.10±1.03)%ID/g]及^(64)Cu-NOTA-IgG在Karpas299肿瘤的摄取[(5.12±0.89)%ID/g],差异均有统计学意义(F=290.99,t值:19.65和22.25,均P<0.001)。^(64)Cu-NOTA-CD30与^(64)Cu-NOTA-IgG在各组心、肝的摄取随时间延长逐渐降低。48 h体外生物分布结果与活体microPET显像基本一致。结论^(64)Cu-NOTA-CD30能在活体水平无创性可视化评价淋巴瘤CD30的表达及分布情况,有望应用于靶向CD30免疫治疗的受益群体筛选及疗效评价。

抗肿瘤抗体药物研究进展

自1997年以来,抗体药物用于肿瘤治疗取得突破性的进展。据统计,国内外已有约17种抗体药物被批准用于临床肿瘤治疗。除了一直比较成功的裸抗体,抗体药物偶联物(ADC)成为抗肿瘤抗体药物研发的新热点。抗原靶标及作用机制特点决定了抗肿瘤抗体药物在临床的安全性和疗效。本文主要从肿瘤细胞杀伤机制、作为抗体靶标的肿瘤抗原、在临床的应用情况及ADC纳米粒研究方面对抗肿瘤抗体药物进行了综述。

单域抗体与力达霉素的基因工程强化融合蛋白VL-LDP-AE的制备及其抗肿瘤作用

Ⅳ型胶原酶与肿瘤的侵袭、转移及新血管生成等过程密切相关.单域抗体作为肿瘤靶向性载体有许多传统抗体所无法比拟的优势.以Ⅳ型胶原酶为靶点,以单域抗体为载体,以强效烯二炔抗肿瘤抗生素力达霉素(LDM)为“弹头”,采用DNA重组与分子组装相结合的新方法,制备抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11的轻链可变区单域抗体VL与LDM的基因工程强化融合蛋白VL-LDP-AE.MTT结果表明,VL-LDP-AE对体外培养的肿瘤细胞有强烈杀伤作用,对HT-1080细胞和KB细胞的IC50值分别为8.55×10?12和1.70×10^(11)mol/L.VL-LDP-AE还可抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生成并可破坏人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成内皮小管.动物实验观察对小鼠移植性肝癌22(H22)的疗效.皮下接种肿瘤,72h后开始给药(分别在接种后第3和第10天静脉注射2次).以最大耐受剂量进行比较,VL-LDP-AE0.375mg/kg的抑瘤率为89.5%,LDM0.05mg/kg组的抑瘤率为69.9%,丝裂霉素(MMC)1mg/kg组的抑瘤率为35%.VL-LDP-AE的分子量为25.4kD,远小于其他形式的抗体药物分子.作为小型、高效的抗体药物,VL-LDP-AE在肿瘤靶向治疗中有良好应用前景.此外,其独特的制备方法还可作为制备新型抗肿瘤抗体靶向药物的技术平台.

抗体工程药物标联及增效技术

近年来，抗体类药物以其安全有效、特异性高等优点，已成为国际药品市场上一大类新型治疗和诊断剂。目前，美国食品和医药管理局（FDA）已批准了约37种治疗性抗体药物，全球有超过200家公司正在研发治疗用单抗药物。与正常组织相比，已经证实许多抗原在一些特定的肿瘤细胞过度表达，因此肿瘤治疗是抗体药物临床应用很多的领域。

抗表皮生长因子受体噬菌体抗体库的构建筛选及单链抗体可溶性表达

近年来的研究表明,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是肿瘤治疗中一个很重要的靶点。本研究应用噬菌体展示技术筛选EGFR特异性单链抗体(single chainF v,scFv)。利用高表达EGFR的人鳞状上皮癌细胞A431免疫小鼠,提取脾细胞mRNA,RT-PCR扩增VH和VL基因并拼装成scFv基因。将scFv基因连接到噬菌粒pCANTAB 5E中,电击转化E.coli TG1细胞,构建了库容为2.5×107的噬菌体单链抗体库。用纯化的EGFR为靶抗原对噬菌体抗体库进行5轮富集筛选,得到次级抗体库6F-10。挑取48个克隆进行ELISA测定,45个克隆为阳性。取阳性值最高的克隆感染E.coli HB2151,IPTG诱导scFv的表达。scFv(约27kD)以可溶形式存在于细胞质及细胞周质中,并可分泌至上清液。测序结果表明,scFv基因序列全长768bp,编码256个氨基酸。VH为与小鼠Ig同源的重链可变区基因,VL为κ型轻链可变区基因;VH和VL均由3个抗原互补决定区和4个框架区构成。免疫印迹和细胞免疫荧光显示,可溶性scFv可分别与纯化的EGFR抗原以及细胞表面的EGFR发生特异性结合。抗EGFR特异性scFv的获得,为研制靶向EGFR的抗体药物与研究生物治疗提供导向载体分子。

抗表皮生长因子受体的单链抗体ER(Fv)的构建及其抗肿瘤活性研究

目的利用大肠杆菌表达抗表皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体并对其抗肿瘤活性进行研究。方法构建含有抗EGFR单链抗体基因片段的重组质粒,IPTG诱导大肠杆菌表达单链抗体ER(Fv),用Ni离子亲和柱纯化单链抗体。ELISA测定ER(Fv)与纯EGFR抗原的结合能力;流式细胞术分析ER(Fv)与肿瘤细胞的结合;MTT法检测ER(Fv)对肿瘤细胞体外增殖的影响;动物试验测定ER(Fv)的体内抑瘤效果。结果应用基因工程菌表达带有组氨酸标签肽(His-tag)的单链抗体ER(Fv),相对分子质量约为27×103,主要以包涵体形式存在,收获量约为10 mg.L-1。ELISA测定ER(Fv)与纯EGFR抗原的亲和常数为4.0×107 L.mol-1。单链抗体能与肿瘤细胞表面的EGFR发生特异性结合,其与3种EGFR高表达肿瘤细胞的解离常数皆为10-7 mol.L-1。细胞增殖实验显示,单链抗体可抑制EGFR高表达肿瘤细胞的增殖。体内抑瘤实验表明,单链抗体对人鳞状上皮癌A431裸鼠移植瘤具有中度的生长抑制作用,5,10和20 mg.kg-1 3个剂量组35 d的抑瘤率分别为43.9%、46.7%和54.8%,与对照组相比存在显著差异。结论成功地表达了抗EGFR单链抗体ER(Fv),其对肿瘤细胞具有良好的亲和力和一定的生长抑制作用,为研制靶向EGFR的抗体药物提供基础。